天然低共熔溶劑提取油茶蒲中植物多酚的研究

丁澤敏,吳俊鋒，劉文婷，曾朝喜，郭時印

(湖南農業大學食品科學技術學院，湖南省菜籽油營養健康與深度開發工程技術研究中心，長沙 410128)

油茶蒲是油茶果的最外層，含有茶皂素、木質素等成分，是化學工業、輕工業等的原料，能夠用來制作活性炭等產品[1]。在油茶果加工過程中，油茶蒲常被當成廢棄物焚燒，開發和利用的比例非常低。我國每年有百萬噸油茶蒲，合理開發利用這種副產物有很大的意義[2]。在國內外油茶蒲利用和研究方面的重點常放在茶皂素提取和活性炭制備上，但隨著研究的深入，油茶蒲中含量豐富的多酚類物質日益受到關注。

植物多酚(Plant polyphenol)是主要存留于水果、谷類、豆類、茶等植物內的復雜酚類構造的化合物，多位于葉片、果殼、果肉中[3]。植物多酚按結構可以分成酚酸類、類黃酮類和1,2-二苯乙烯及木酚素類[4]。由于多酚結構的特殊性，使其擁有很好的抗氧化和清除自由基的作用。近年來的研究發現植物多酚在預防生理機能退化，降低血液中的葡萄糖含量，防御和治療循環系統疾病，清除人體的游離基等方面都具有驚人的效果，因此有“第7營養素”的美譽[5]。在植物多酚的研究中，分離提取是其中關鍵的一環。將酸性甲、乙醇或者丙酮和水用于多酚的水浴加熱浸提的方法比較常見[6]。但是傳統方法不僅在環保性和安全性上存在缺陷，同時還存在不能滿足同時快速萃取不同極性產物和保持產物活性的問題。

2004年，Abbott等[7]首次提出了低共熔溶劑(Deep eutectic solvents)的概念，并在之后將其應用于多個領域。低共熔溶劑是一種由氫鍵供體和氫鍵受體組成的低熔混合物[8]，由于其組分的安全性和生物可降解性，被認為是一種綠色溶劑。2011年由Choi實驗室提出的一種新型溶劑概念——天然低共熔溶劑(Natural deep eutectic solvent)，這是一種全部使用葡萄糖、蔗糖等糖類，強有機堿及其衍生物，尿素等小分子生物代謝產物作為成分構成的低共熔溶劑[9]，被認為是新一代的設計溶劑，用于天然產物提取，具有綠色、高效、提取的產物極性范圍廣和保持產物高活性等優勢[10]。目前天然低共熔溶劑用于生物活性物質的提取剛剛起步，對于其提取機制還不清楚。

Wei等[11]將天然低共熔溶劑用于木豆葉中酚類物質的提取，結果表明該溶劑能提取比傳統溶劑極性范圍更廣的酚類物質。之后，Wei等[12]又用氯化膽堿-乳酸溶劑提取了黃芩中的4種主要的黃酮類物質，都獲得很好的提取率。Nam等[13]發現在槐花的黃酮類物質的提取中，天然低共熔溶劑比傳統溶劑的提取效率更高，重要的是在黃酮類物質提取中其體現出了更高的生物活性。Radosevic等[14]也證明天然低共熔溶劑能提高植物提取物的生物活性。García等[15]從橄欖油中提取酚類物質，結果發現兩種環烯醚萜在天然低共熔溶劑的提取率相較于傳統溶劑分別提高了20%～33%和67.9%～68.3%。

本研究將天然低共熔溶劑應用于提取油茶蒲中植物多酚的工藝中，以多酚得率為評價標準，以不同天然低共熔溶劑、液料比、提取溫度、提取時間等單因素試驗為基本依據，通過響應面分析法優化天然低共熔溶劑提取油茶蒲中植物多酚的工藝條件，以期為開發利用油茶蒲中植物多酚資源及其生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗原料

油茶蒲，購于江西贛州市上饒縣。挑選優質的油茶蒲，沖洗后于烘箱中烘干、粉碎后備用。

1.1.2 主要試劑與溶液配制

福林酚(Folin phenol)、檸檬酸、乙醇、蘋果酸、葡萄糖、沒食子酸、氯化膽堿、碳酸鈉等，購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，均為國產分析純；蒸餾水。

體積分數10%的福林酚溶液：吸取5 mL 福林酚至50 mL容量瓶中，定容。

質量濃度7.5 g/100 mL的碳酸鈉溶液(室溫下可保存1個月)：稱取(15.00±0.01)g碳酸鈉，加一定的蒸餾水溶解，移至200 mL容量瓶中，定容。

不同質量濃度的沒食子酸溶液:參考GB/T 8313—2008。稱取一定量沒食子酸置于燒杯中，加適量蒸餾水溶解后，轉移到50 mL容量瓶中，定容、搖勻，放置片刻后，分別移取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL溶液于50 mL容量瓶中，定容、搖勻，配成質量濃度分別為10、20、30、40、50 μg/mL的標準溶液。

1.1.3 主要儀器與設備

BJ-500A型高速多功能粉碎機，浙江德清拜杰電器有限公司；FA-B分析天平，上海精科精密科學儀器有限公司；722S紫外可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；DK-98ⅡA電熱恒溫水浴鍋，天津泰斯特儀器有限公司；RE52CS-1旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；TDZ5-WS多管架自動平衡離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 油茶蒲中多酚的提取

準確稱取0.25 g油茶蒲，裝入玻璃試管中，分別加入一定體積不同摩爾比的低共熔溶劑作為提取溶劑，將其放入一定溫度的恒溫水浴鍋中，提取一定時間后，取出過濾，對濾液進行分析。

1.2.2 多酚含量測定及得率計算

待測液：將1.2.1的濾液取1.0 mL 于100 mL容量瓶中，定容、搖勻，待測。

參考林玉芳等[16]方法對多酚進行測定。移取沒食子酸標準溶液、水和待測液各1.0 mL，并分別加入5.0 mL 10%的福林酚試劑，振動，靜置3～8 min后加入4.0 mL 7.5 mg/100 mL碳酸鈉溶液，搖勻，常溫避光60 min后,以水為參比，置于分光光度計765 nm下測吸光度。以沒食子酸標準溶液質量濃度(x)為橫坐標，吸光度(y)為縱坐標作曲線，并進行線性回歸，得到相應的標準曲線回歸方程：y=0.112 7x+0.028 9(R2=0.999 7)。

根據待測液的吸光度，按照下式計算多酚得率。

式中：A為待測液的吸光度；b為標準曲線截距；V為提取液的體積；d為稀釋倍數；kd為標準曲線斜率；m為油茶蒲質量，g。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 不同提取溶劑對多酚得率的影響

提取溶劑對天然產物的提取效果有關鍵作用，本研究選擇了兩種有機酸和膽堿鹽按不同摩爾比組合形成的天然低共熔溶劑作為新型提取溶劑，并以傳統提取溶劑水和60%乙醇為對比，在液料比20∶1、提取溫度50℃、提取時間40 min條件下，考察不同提取溶劑對油茶蒲中多酚提取的影響，結果見表1。

表1 不同提取溶劑對多酚得率的影響

由表1可知，天然低共熔溶劑組分的摩爾比對溶劑的提取效果有顯著影響，檸檬酸-氯化膽堿(摩爾比1∶3)和蘋果酸-氯化膽堿(摩爾比1∶2)的多酚得率分別達到0.763%和0.647%，明顯高于兩種傳統溶劑60%乙醇和水，而檸檬酸-氯化膽堿(摩爾比1∶2)和蘋果酸-氯化膽堿(摩爾比1∶3)的多酚得率則低于60%乙醇。因此，當采用天然低共熔溶劑作為天然產物提取溶劑時，有必要考慮不同溶劑組分比例的影響。

2.1.2 提取時間對多酚得率的影響

以檸檬酸-氯化膽堿(摩爾比1∶3)作為提取溶劑，在液料比20∶1、提取溫度50℃條件下，考察不同提取時間對油茶蒲中多酚提取的影響，結果見圖1。

圖1 提取時間對多酚得率的影響

由圖1可見， 隨著提取時間的延長，多酚得率明顯提高， 40 min達到最高值，繼續延長提取時間，多酚得率沒有明顯變化。這主要是因為在不改變其他條件下，提取40 min已經將多酚最大程度提取，多酚提取量達到了峰值，因此繼續延長提取時間并不能改變多酚得率。綜合考慮，在此提取條件下，提取時間范圍在30～50 min較為穩妥。王翼等[17]在對合歡花中多酚進行提取時，先通過石油醚脫脂，再用乙醇進行提取，得出的最佳提取時間為1.0 h。由此可知，新型的天然低共熔溶劑作為提取溶劑能有效地縮短提取時間。

2.1.3 提取溫度對多酚得率的影響

以檸檬酸-氯化膽堿(摩爾比1∶3)作為提取溶劑，在液料比20∶1、提取時間40 min條件下，考察不同提取溫度對油茶蒲中多酚提取的影響，結果見圖2。

圖2 提取溫度對多酚得率的影響

由圖2可知，在本試驗溫度范圍內，比較高的溫度和比較低的溫度都不利于多酚的提取。在低溫條件下，多酚得率較小，溫度升高，多酚得率也逐漸提高，在80℃時多酚得率達到了峰值，之后溫度繼續升高，多酚得率反而下降。這可能是因為比較高的溫度將一些存在于茶油蒲中的熱敏性的成分分解所致。馬永強等[18]在研究玉米芯植物多酚的提取工藝時，得出的有機溶劑最佳提取溫度為80℃。孫建[19]在研究荷葉中多酚的提取時，用乙醇有機溶劑的最佳提取溫度為65℃。由此考慮，本試驗提取溫度范圍在70～90℃較為合理。

2.1.4 液料比對多酚得率的影響

以檸檬酸-氯化膽堿(摩爾比1∶3)作為提取溶劑，在提取溫度80℃、提取時間40 min條件下，考察液料比對油茶蒲多酚得率的影響，結果見圖3。

圖3 液料比對多酚得率的影響

由圖3可知，隨液料比的增加，多酚得率升高，在液料比為40∶1時達到峰值，之后繼續增加液料比，多酚得率反而開始明顯下降。姚永志等[20]用乙醇水溶液提取花生紅衣多酚，得出最佳提取料液比為1∶37.5，提取率達到7.9%。很多學者發現，有機溶劑和水的復合體系適合多酚物質的提取，有機溶劑含量一般為50%～70%[21-23]。用低共熔溶劑提取的液料比大致與有機溶劑相似，出于成本和得率的考慮，液料比選取定在(30～50)∶1。

2.2 響應面試驗

根據單因素試驗結果，以檸檬酸-氯化膽堿(摩爾比1∶3)為提取溶劑，以多酚得率為響應值，以提取時間、提取溫度和液料比為影響因素，采用Design Expert 8.0.6軟件進行三因素三水平響應面試驗設計及結果分析。因素及水平見表2，響應面設計方案與結果見表3，方差分析見表4。

表2 因素及水平

表3 響應面設計方案與結果

表4 方差分析

注:**表示極顯著水平(P<0.01);*表示顯著水平(P<0.05)。

應用Design Expert 8.0.6擬合表4中的數值，得到二次多項回歸模型：

根據分析，得出響應值的最大預測值為0.934 2%，此時工藝條件為提取時間36.54 min、提取溫度80.67℃、液料比42.15∶1。為了方便實際操作，確定 提取工藝條件為提取時間37 min、提取溫度81℃、液料比42∶1，在此條件下對油茶蒲中多酚提取進行3次驗證試驗，平均多酚得率為0.932 1%，接近預測值。

3 結 論

本試驗通過對比傳統的水和60%乙醇溶液，發現天然低共熔溶劑對油茶蒲中的多酚具有更好的提取效果。通過單因素試驗和響應面試驗確定天然低共熔溶劑提取油茶蒲中多酚的最優條件為：提取溶劑檸檬酸-氯化膽堿(摩爾比1∶3)，提取時間37 min，提取溫度81℃，液料比42∶1。在最優條件下，多酚得率為0.932 1%。