紫蘇籽中不同蛋白組分的功能性質研究

劉 寧，趙 佳，武選民，同紅娟，代春吉，常大偉，李 超

(1.陜西科技大學 食品與生物工程學院，西安710021； 2.西安風吹麥浪農產品技術開發有限公司，西安710003； 3.楊凌子蘇生物科技有限公司，陜西 楊凌712100)

植物蛋白具有生產周期短、產量大、資源豐富等優點，越來越多的科研工作者把尋找和開拓新的蛋白質資源及提高蛋白質利用率和附加值作為研究重點[1]。紫蘇在我國種植廣泛，是傳統的藥食兩用植物資源。紫蘇籽粕是紫蘇籽提油后的副產品，其中蛋白質含量高且雜質少，氣味良好且無毒無害，是良好的蛋白質來源。目前，紫蘇籽粕僅作為動物飼料或充當肥料等，其自身價值未能得到充分利用[2]，在高值化利用方面有一定的不足，因此紫蘇籽粕具有良好的開發前景。

謝超等[3]研究了等電點法提取紫蘇籽蛋白的最佳工藝條件，最終獲得純度為88.81%(干基)的紫蘇籽蛋白。盛彩虹等[4]以大豆分離蛋白為對照，研究了紫蘇分離蛋白的功能性質，發現紫蘇分離蛋白的乳化穩定性與大豆分離蛋白相當。目前，學者們的研究多集中在紫蘇籽蛋白的提取工藝，或其中某一種蛋白組分的功能性質，關于紫蘇籽中不同蛋白組分的功能性質差異研究較少[5]。本文采用堿溶酸沉法提取紫蘇籽分離蛋白以及Osborne分級法提取紫蘇籽清蛋白、球蛋白，并對3種蛋白質的功能性質進行研究，以期為紫蘇資源的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

紫蘇籽，西安風吹麥浪農產品技術開發有限公司；大豆油，中糧集團食品有限公司；甘氨酸、三羥甲基氨基甲烷、β-巰基乙醇、丙烯酰胺、四甲基乙二胺，生工生物工程有限公司；考馬斯亮藍R-250，美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

K9840凱氏定氮儀，Membrapure A-300氨基酸分析儀，FYY-6D電泳儀，Q2000差示掃描量熱儀，FA25高剪切分散乳化機，UV-VS 2501PC紫外-可見分光光度計。

1.2 實驗方法

1.2.1 紫蘇籽脫脂粉的制備

將紫蘇籽用研磨機粉碎，過60目篩，取一定量紫蘇籽粉于燒杯中，加入3倍質量的石油醚(沸程60～90℃)在室溫下攪拌30 min，提取2次，利用旋轉蒸發儀除去石油醚，置于通風櫥揮干，得紫蘇籽脫脂粉，過80目篩，收集備用。

1.2.2 紫蘇籽及其脫脂粉的成分測定

粗蛋白質含量、粗脂肪含量、粗纖維含量、水分含量和灰分含量的測定分別參照GB 5009.5—2016、GB 5009.6—2016、GB/T 6434—2006、GB 5009.3—2016、GB 5009.4—2016進行。

1.2.3 紫蘇籽不同蛋白組分的提取

取一定量紫蘇籽脫脂粉與去離子水按料液比1∶20 混合，用2 mol/L NaOH調pH至9，于50℃下攪拌1 h后，以8 000 r/min離心5 min，取上清液，用2 mol/L HCl將上清液的pH調至4。以8 000 r/min離心5 min，取沉淀用去離子水洗滌3次。用0.5 mol/L NaOH調pH至中性，凍干后即得紫蘇籽分離蛋白。

清蛋白和球蛋白采用Osborne分級法提取[6]。將紫蘇籽脫脂粉與去離子水按料液比1∶12混合后充分攪拌2 h，于4℃下以10 000 r/min離心30 min，重復提取2次取上清液(沉淀收集用于提取球蛋白)。將上清液pH調為4，靜置30 min，于4℃下以10 000 r/min離心15 min，取沉淀復溶調pH至中性，透析2 d，凍干得紫蘇籽清蛋白。將清蛋白提取時收集的沉淀用2%的NaCl溶液按料液比1∶12混合攪拌2 h，于4℃下以10 000 r/min離心15 min，重復提取2次合并上清液，用HCl將上清液pH調為4，靜置30 min，于4℃下以10 000 r/min離心15 min，取沉淀復溶，調pH至中性，透析2 d后凍干，即得紫蘇籽球蛋白。由于常見植物種子中清蛋白、球蛋白功能特性較好[7]，因此本文不再提取醇溶蛋白、谷蛋白。

1.2.4 不同蛋白的氨基酸組成分析

分別稱取一定量的蛋白粉于水解管中，加入5 mL 6 mmol/L的HCl，在110℃烘箱中水解24 h后冷卻，加去離子水定容到25 mL。取1 mL水解液于小燒杯中，在60℃烘箱中脫酸后加入1 mL檸檬酸鈉緩沖液(pH 2.2)，過0.22 μm的濾膜，利用Membrapure A-300氨基酸分析儀測定紫蘇籽蛋白的氨基酸組成[8](色氨酸經堿水解后測定)。

1.2.5 SDS-PAGE電泳測定

根據Laemmli[9]的方法，電泳用濃縮膠質量分數為5%，分離膠質量分數為12%，用0.025 mmol/L Tris-Gly緩沖液溶解蛋白樣品，取10 μL樣品加入到每個孔中。用0.1%的考馬斯亮藍R-250染液染色180 min，洗脫液為甲醇-冰醋酸-水(體積比1∶1∶8)，洗脫4次。所得結果與Marker進行對照分析。

1.2.6 差示掃描量熱法(DSC)圖譜分析

準確稱取2 mg蛋白樣品，置于空鋁盤中，加入10 μL蒸餾水后密封。用一個空鋁盤作為對照，參數設置為：溫度掃描范圍0～155℃，升溫速率6℃/min，氮氣流速55 mL/min[10]。

1.2.7 不同蛋白的持水性及持油性測定

1.2.7.1 持水性的測定

稱取1.0 g蛋白樣品置于50 mL離心管中，向離心管中加入30 mL pH為7的去離子水，在常溫下攪拌1.5 h，以8 000 r/min離心10 min，收集沉淀，記錄沉淀與離心管的總質量，按下式計算每克樣品對水的保持量。

式中：m0為蛋白樣品的質量，g；m1為離心管質量，g；m2為吸水后蛋白及離心管的總質量，g。持水性單位最后換算成mL/g。

1.2.7.2 持油性的測定

稱取1.0 g蛋白樣品置于50 mL離心管中，向離心管中加入20 mL食用大豆油，攪拌2 min，在常溫下靜置30 min后，以2 000 r/min離心10 min，記錄吸油后蛋白與離心管總質量，按下式計算每克樣品對油的保持量。

式中：m0為蛋白樣品的質量，g；m1為離心管的質量，g；m2為吸油后蛋白與離心管總質量，g。持油性單位最后換算成mL/g。

1.2.8 不同蛋白的溶解性測定

根據Aluko等[11]的方法進行測定。取0.5 g蛋白樣品與50 mL去離子水混合均勻，將蛋白分散液的pH調為1～10，在常溫下攪拌1.5 h后，以6 000 r/min離心10 min，棄去沉淀，收集上清液，定容到100 mL容量瓶中。用凱氏定氮法測定上清液中蛋白質含量，按下式計算蛋白溶解性。

溶解性=W2/W1×100%

式中：W1為原樣品中粗蛋白質質量，g；W2為上清液中粗蛋白質質量，g。

1.2.9 不同蛋白的乳化活性(EAI)及乳化穩定性(ESI)測定

分別配制2%的蛋白溶液，將溶液pH調節為2～9，將大豆油和上述蛋白溶液按1∶3混合均勻，以20 000 r/min均質1 min，量取均質后的乳液50 μL，用0.1% SDS稀釋100倍后于500 nm處測定吸光度[12]。按下式計算EAI和ESI。

式中：EAI為乳化活性，m2/g ;DF為乳液稀釋倍數，本實驗中DF=100；C為蛋白質量濃度，g/mL；?為光程，?=0.01 m；θ為油相體積分數，θ=0.25；ESI為乳化穩定性，min；A0、A10分別為均質后0 min和10 min時的吸光度。

2 結果與討論

2.1 紫蘇籽及其脫脂粉的成分(見表1)

表1 紫蘇籽及其脫脂粉的成分 %

由表1可知，紫蘇籽中粗脂肪含量較高，達48.36%，粗蛋白質和粗纖維含量分別為23.30%和26.32%，而紫蘇籽脫脂粉中含有較多的粗蛋白質，含量達39.85%，表明紫蘇籽脫脂粉是良好的植物蛋白資源。

2.2 不同蛋白組分的得率

實驗采用不同方法提取紫蘇籽脫脂粉中的蛋白質，結果發現，紫蘇籽脫脂粉中蛋白質含量豐富，經堿溶酸沉法提取，分離蛋白的得率為34.75%。分級提取的清蛋白和球蛋白得率分別為12.52%和20.85%。

2.3 氨基酸組成(見表2)

表2 不同紫蘇籽蛋白的氨基酸組成及含量 %

注：*表示必需氨基酸。

由表2可知，紫蘇籽蛋白的氨基酸組成豐富，3種蛋白中必需氨基酸種類齊全，谷氨酸和精氨酸含量均較高。因此，攝入紫蘇籽蛋白可以滿足人體對必需氨基酸的需求，紫蘇籽蛋白是一種優良的植物蛋白資源。

2.4 SDS-PAGE圖譜(見圖1)

圖1 不同紫蘇籽蛋白的SDS-PAGE圖譜

由圖1可知，紫蘇籽蛋白的SDS-PAGE圖譜中均有多條清晰可見的條帶，表明紫蘇籽蛋白由多個亞基組成。清蛋白與球蛋白具有相似的條帶分布，電泳圖譜包含4條清晰可見的條帶，相對分子質量分別為45、25、20 kDa和5～10 kDa。分離蛋白的電泳圖譜與清蛋白、球蛋白的稍有區別，清晰可見相對分子質量范圍分別為25～36 kDa和15～20 kDa的兩個條帶，這可能由于分離蛋白采用堿溶酸沉法提取，相比清蛋白、球蛋白提取時的pH更高，能夠溶出更大相對分子質量的蛋白組分。

2.5 DSC圖譜(見圖2)

圖2 不同紫蘇籽蛋白的DSC圖譜

由圖2可知，不同紫蘇籽蛋白的DSC圖譜均只有一個光滑的吸熱峰，表明這3種蛋白組分純度較高，其吸收峰均呈向內凹陷的單吸熱峰[13]。不同紫蘇籽蛋白的熱學特性見表3。

表3 不同紫蘇籽蛋白的熱學特性

由表3可知：紫蘇籽清蛋白、球蛋白和分離蛋白的熱變性溫度Td相近，分別為107.36 、104.58℃和107.45℃；與其他兩種蛋白相比，球蛋白的Td較低。半峰寬ΔTd主要反映蛋白在熱變性過程中的協同性[14]，清蛋白的ΔTd小于其他兩種蛋白，表明清蛋白更易在較窄的溫度范圍發生完全變性[12]，而分離蛋白完全變性所需的溫度范圍更寬。

2.6 不同蛋白的持水性及持油性(見圖3)

圖3 不同紫蘇籽蛋白的持水性、持油性

由圖3可知，紫蘇籽清蛋白具有較高的持水性和持油性，分別為3.63 mL/g和3.72 mL/g，球蛋白和分離蛋白持水性分別為2.36 mL/g和2.79 mL/g。蛋白顆粒與水接觸后，會發生吸水溶脹，有報道稱適合做黏性食品的蛋白持水性處于1.49～4.72 mL/g范圍內[15]。持油性對蛋白具有實際應用價值，球蛋白和分離蛋白的持油性分別為2.93 mL/g和3.14 mL/g，而清蛋白的持油性最高，這可能是因為其分子結構更加開放[5]。

2.7 不同蛋白的溶解性(見圖4)

圖4 不同紫蘇籽蛋白的溶解性

由圖4可知，3種蛋白的溶解性變化趨勢較一致，均呈現出U型的溶解性曲線。當pH在等電點附近時，蛋白的溶解性都較低；當pH偏離等電點較遠時，蛋白的溶解性均逐漸增大。不同蛋白中，溶解性高低順序依次為球蛋白、清蛋白、分離蛋白；球蛋白溶解性高于其他兩種蛋白，在pH為10時達到最高，為85.3%。

2.8 不同蛋白的乳化活性(EAI)及乳化穩定性(ESI)(見圖5)

由圖5可知，紫蘇籽蛋白的乳化活性與乳化穩定性曲線都表現出U型趨勢。當pH為4時，3種蛋白的EAI和ESI均最低，清蛋白分別為26.1 m2/g和19.7 min，球蛋白分別為25.3 m2/g和16.6 min，分離蛋白分別為23.2 m2/g和7.1 min。當pH為9時，3種蛋白的EAI和ESI均最高。同時，當pH偏離等電點時，3種蛋白的EAI及ESI均表現出增加趨勢。這與姜文鑫等[5]的研究結果較為相近。

圖5 不同紫蘇籽蛋白的乳化活性與乳化穩定性

3 結 論

本研究采用堿溶酸沉法和Osborne分級法提取了紫蘇籽中分離蛋白、清蛋白和球蛋白，并研究了其功能性質。結果發現：紫蘇籽脫脂粉中蛋白質含量豐富，3種蛋白中谷氨酸、精氨酸含量較高，均含有8種必需氨基酸；清蛋白和球蛋白的亞基組成相近，分離蛋白具有較好的熱穩定性；清蛋白的持水性和持油性高于其他兩種蛋白；在pH 1～10范圍內，3種蛋白的溶解性均呈現出U型變化趨勢，其中球蛋白的溶解性最好；在pH 2～9范圍內，球蛋白的乳化活性及乳化穩定性均優于其他兩種蛋白。