黃芩苷對(duì)馬兜鈴酸誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷的保護(hù)作用

賈亦臣， 楊 橙， 鄭 龍， 李佳蔚， 曾毅剛， 許 明， 朱同玉， 戎瑞明,3*

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院泌尿外科，上海 200032 2. 上海市器官移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032 3. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院輸血科，上海 200032

馬兜鈴酸腎病是由于攝入含有馬兜鈴酸的植物或食物而引起的進(jìn)行性腎小管間質(zhì)中毒，最終導(dǎo)致終末期腎病[1]。雖然含有馬兜鈴酸的產(chǎn)品已在許多國(guó)家被限制使用，但馬兜鈴酸腎病仍在世界各地大量報(bào)道，且由于目前對(duì)該疾病的認(rèn)識(shí)尚不充分，其發(fā)病率可能被嚴(yán)重低估[2]。在我國(guó)，中草藥使用廣泛但成分復(fù)雜，部分含馬兜鈴酸的藥物仍在使用。2017年10月30日國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局官方網(wǎng)站公布了《含馬兜鈴屬藥材的已上市中成藥品種名單》共47種、《可能含有馬兜鈴酸的馬兜鈴科藥材名單》共24種。馬兜鈴酸腎病可進(jìn)展至終末期腎病，許多腎移植受者在接受腎移植前有明確的馬兜鈴酸腎病或含馬兜鈴酸藥物服用史[3]。馬兜鈴酸對(duì)腎臟損害巨大，先前研究發(fā)現(xiàn)，大劑量的馬兜鈴酸可在短時(shí)間內(nèi)直接引起腎臟近端小管上皮細(xì)胞損傷，導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞變性凋亡壞死[4-5]，臨床病理表現(xiàn)為近端小管進(jìn)行性萎縮、間質(zhì)明顯纖維化及快速進(jìn)展為終末期腎病[3]。

黃芩苷一種是從黃芩根中分離出來(lái)的化合物，目前廣泛用于治療感染性和炎癥性疾病[6-7]。既往研究[8-10]發(fā)現(xiàn)，黃芩苷對(duì)急性器官損傷具有明顯的保護(hù)作用。黃芩苷可通過抑制炎性因子TNF-α、IL-6的產(chǎn)生并上調(diào)ZO-1的表達(dá)來(lái)保護(hù)脂多糖誘導(dǎo)的急性小腸上皮細(xì)胞損傷[8]；黃芩苷可通過抑制TNF-α、IL-1β等促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生來(lái)減輕大鼠腎臟缺血再灌注損傷[9]；黃芩苷緩解空氣栓塞大鼠的肺毛細(xì)血管通透性、肺血管壓力及支氣管肺泡灌洗液中蛋白質(zhì)濃度，且該作用與炎性因子及中性粒細(xì)胞趨化因子的減少相關(guān)[10]。基于黃芩苷對(duì)急性器官損傷的明確保護(hù)作用，本研究旨在通過建立小鼠馬兜鈴酸誘導(dǎo)急性腎損傷模型來(lái)探討黃芩苷對(duì)馬兜鈴酸引起的急性腎損傷的作用及其初步機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 C57小鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。20～25 g雄性小鼠飼養(yǎng)于復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物房，自由飲水進(jìn)食，動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)環(huán)境1周。該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)通過了復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)中Bcl-2和Bax抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司，TUNEL凋亡試劑盒購(gòu)自Millipore公司，馬兜鈴酸和黃芩苷購(gòu)自Sigma公司。

1.2 馬兜鈴酸誘導(dǎo)的急性腎損傷模型 SPF級(jí)雄性C57小鼠(體質(zhì)量20～25 g)，隨機(jī)分為4組，對(duì)照組：腹腔注射等量生理鹽水。模型組(即馬兜鈴酸誘導(dǎo)的急性腎損傷組)：腹腔注射馬兜鈴酸(10 mg/kg)。黃芩苷低劑量治療組：腹腔注射馬兜鈴酸建立急性腎損傷模型后，隨即腹腔注射黃芩苷(10 mg/kg)，此后2 d同一時(shí)間再每日給藥1次，共連續(xù)給藥3 d。黃芩苷高劑量治療組：腹腔注射馬兜鈴酸建立急性腎損傷模型后，隨即腹腔注射黃芩苷(100 mg/kg)，此后2 d同一時(shí)間再每日給藥1次，共連續(xù)給藥3 d。每組各6只小鼠，各組小鼠于模型建立后第3天通過戊巴比妥麻醉后收集心臟血及腎臟標(biāo)本用于后續(xù)檢測(cè)。

1.3 腎功能檢測(cè) 各組小鼠心臟血在4 000 r/min， 4℃條件下離心10 min，并收集上層血清。后通過全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清肌酐、尿素氮水平，比較各組腎功能差異。

1.4 組織病理 小鼠腎臟組織用10%甲醛溶液固定后石蠟包埋，切片機(jī)切取厚約3～5 μm白片，白片脫蠟后行H-E染色。請(qǐng)與該實(shí)驗(yàn)無(wú)關(guān)的兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)生采用雙盲方法觀察各組H-E染色切片，并使用正置顯微鏡在每張切片上隨機(jī)取10處視野拍片(放大200倍)分析評(píng)分。根據(jù)腎臟損傷(腎小管擴(kuò)張、間質(zhì)擴(kuò)張水腫和炎癥浸潤(rùn)水平)面積進(jìn)行評(píng)分(0～3分)。0分：正常腎臟(無(wú)損傷)；1分：輕度損傷 (<25% 損傷)； 2分：中度損傷 (25%～50% 損傷)； 3分：重度損傷 (>50%損傷)。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 小鼠腎臟組織包埋后，切片機(jī)切取厚約3～5 μm白片，白片脫蠟后按照試劑盒說明書行TUENL(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP biotin nick end labeling, TUNEL)染色。凋亡細(xì)胞在200倍視野下連續(xù)觀察10個(gè)視野進(jìn)行評(píng)分。

1.6 免疫印跡 采用上海碧云天生物技術(shù)有限公司的蛋白抽提試劑盒按試劑盒說明提取小鼠腎組織蛋白。Western印跡的實(shí)驗(yàn)步驟如之前參考文獻(xiàn)[11]所描述。通過Image J軟件分析Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)情況。

2 結(jié) 果

2.1 黃芩苷改善馬兜鈴酸引起的腎功能損傷 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，模型組中血肌酐和尿素氮水平明顯升高；低劑量黃芩苷治療后未見明顯改善，但高劑量黃芩苷治療后血肌酐和尿素氮水平明顯下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)。

圖1 各組小鼠血肌酐和尿素氮水平的對(duì)比

2.2 黃芩苷改善馬兜鈴酸引起的腎臟損傷 結(jié)果(圖2)發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組相比，模型組和黃芩苷低劑量組中可見明顯腎小管擴(kuò)張(近端小管表現(xiàn)更為顯著)、間質(zhì)擴(kuò)張水腫和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；與模型組相比，黃芩苷高劑量組腎小管擴(kuò)張、間質(zhì)擴(kuò)張水腫明顯減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少。與模型組和黃芩苷低劑量組相比，腎損傷評(píng)分明顯減少，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 各組小鼠腎臟組織H-E染色及半定量評(píng)分

2.3 黃芩苷可減輕馬兜鈴酸引起的腎臟組織細(xì)胞凋亡 結(jié)果(圖3)發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組相比，模型組和黃芩苷低劑量組小鼠腎組織凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加；高劑量黃芩苷治療后腎組織凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.05)，提示黃芩苷可減輕馬兜鈴酸引起的腎臟組織細(xì)胞凋亡。

2.4 黃芩苷改變馬兜鈴酸引起的腎臟組織中Bax蛋白和Bcl-2蛋白的表達(dá) 結(jié)果(圖4)發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組相比，模型組中Bax明顯升高，Bcl-2明顯降低。低劑量黃芩苷治療后未見明顯改善，但高劑量黃芩苷治療后Bax明顯降低，Bcl-2明顯升高，提示黃芩苷可改變馬兜鈴酸引起的腎臟組織中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)(P<0.05)。

3 討 論

含馬兜鈴酸中草藥或中成藥曾被廣泛使用，目前仍有大量馬兜鈴酸腎病病例存在[2]。馬兜鈴酸是馬兜鈴酸屬的主要次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有嚴(yán)重的腎毒性[4]。隨著對(duì)馬兜鈴酸腎毒性及致癌的認(rèn)識(shí)逐漸加深，近年來(lái)使用已大幅度減少，但馬兜鈴酸造成急慢性腎功能損害仍十分多見[2, 12]，部分嚴(yán)重者可快速進(jìn)展為終末期腎病[3]。研究表明，馬兜鈴酸腎病主要涉及腎小管和腎小管間質(zhì)[13]。單次高劑量的馬兜鈴酸可引起腎小管上皮細(xì)胞明顯凋亡壞死，導(dǎo)致急性馬兜鈴酸腎病[14]。

圖3 各組小鼠腎臟組織TUNEL染色及陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)

圖4 各組小鼠腎組織促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)

本研究發(fā)現(xiàn)，單次注射馬兜鈴酸后小鼠腎小管明顯擴(kuò)張、腎小管間質(zhì)明顯擴(kuò)張水腫，且腎小管上皮細(xì)胞凋亡明顯增加，腎功能明顯受損。而連續(xù)3 d通過腹腔注射100 mg/kg的黃芩苷治療馬兜鈴酸誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷后，小鼠腎小管擴(kuò)張程度、腎小管間質(zhì)擴(kuò)張水腫程度減輕，腎小管細(xì)胞凋亡減少，腎功能損傷明顯減輕。結(jié)果提示黃芩苷對(duì)馬兜鈴酸所致急性腎損傷的保護(hù)作用。 先前研究顯示，黃芩苷具有抗炎性、抗纖維化等多種重要功能。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究也指出黃芩苷具有抑制細(xì)胞凋亡的功能。Wang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)來(lái)減少肝細(xì)胞凋亡，減輕肝損傷。Lin等[16]研究發(fā)現(xiàn)，向培養(yǎng)的人腎小管上皮細(xì)胞中加入H2O2可引起腎小管上皮細(xì)胞凋亡，而黃芩苷可通過抑制氧化應(yīng)激來(lái)減輕腎小管上皮細(xì)胞凋亡。此外，Lin等[9]還發(fā)現(xiàn)，向缺血再灌注損傷的大鼠腹腔中注射黃芩苷后，大鼠腎臟中線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡減少，腎臟缺血再灌注損傷減輕。本研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷治療馬兜鈴酸引起的急性腎損傷后，腎臟中抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)增加、促凋亡蛋白Bax表達(dá)減少。同時(shí)，TUENL染色也發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，高劑量黃芩苷治療組中細(xì)胞凋亡數(shù)明顯減少。結(jié)果證實(shí)黃芩苷具有減輕腎臟細(xì)胞凋亡的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可通過減少腎臟細(xì)胞凋亡來(lái)減輕馬兜鈴酸誘導(dǎo)的急性腎損傷。但對(duì)于黃芩苷減少馬兜鈴酸引起的細(xì)胞凋亡的具體調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

在我國(guó)，中醫(yī)藥群眾基礎(chǔ)深厚，許多中草藥或中成藥確有療效，仍在廣泛使用[17]。但因中草藥成分復(fù)雜，導(dǎo)致許多含馬兜鈴酸的藥物仍在使用。這部分患者在獲取相關(guān)中草藥療效的同時(shí)，也在承受其帶來(lái)的嚴(yán)重不良反應(yīng)。本研究證明黃芩苷可通過減少腎臟細(xì)胞凋亡來(lái)減輕馬兜鈴酸誘導(dǎo)的急性腎損傷。可考慮將黃芩苷與含馬兜鈴酸的中草藥或中成藥配伍使用，減輕馬兜鈴酸導(dǎo)致的腎損傷。