植物酸對煙曲霉菌的抑制作用

張婷 徐巖巖 李潔

摘要：為研究植物酸對煙曲霉的抑制作用，以煙曲霉菌為試驗材料，通過測定植物酸的最小抑菌濃度（MIC），以MIC和1/2MIC的植物酸液體培養(yǎng)煙曲霉，觀察煙曲霉菌絲生長和分生孢子頂囊形態(tài)變化;并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，初步探討其抑菌機(jī)制。結(jié)果表明，植物酸具有抑制煙曲霉生長的作用，最小抑菌濃度為20 μL/mL。在1/2MIC植物酸培養(yǎng)煙曲霉時，菌絲生長受到抑制，菌絲形態(tài)及分生孢子頂囊部分發(fā)育不完全。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示，差異基因代謝通路主要集中在代謝過程，其次是遺傳信息處理。涉及上調(diào)基因數(shù)目較多的代謝通路主要包括氨基酸生物合成、核糖體、氧化磷酸化和氨酰tRNA生物合成。涉及下調(diào)基因數(shù)目較多的代謝通路主要是代謝通路，其次是次級代謝產(chǎn)物的生物合成、抗生素生物合成以及星形孢菌素生物合成。推測植物酸可能是通過干擾煙曲霉生長過程中的多個信號通路及多個相關(guān)基因的表達(dá)而實現(xiàn)抑制作用。

關(guān)鍵詞：植物酸;煙曲霉菌;最小抑菌濃度;轉(zhuǎn)錄組測序;抑菌機(jī)制

中圖分類號： S482.2+92 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）12-0287-06

植物酸是制備活性炭過程中產(chǎn)生的煙氣經(jīng)冷凝回流后收集得到的液體，它的主要成分為酚類和有機(jī)酸，同時含有少量無機(jī)物[1]。近年來，植物酸廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食品等行業(yè)。研究表明，植物酸有較好的抑菌作用。寇成等用精制的植物酸進(jìn)行抑菌試驗，發(fā)現(xiàn)它對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等多種病原菌均有一定的抑制作用[2]。徐巖巖等將植物酸用于平菇細(xì)菌性褐斑病防治，試驗結(jié)果表明，一定濃度植物酸既能有效控制細(xì)菌病害，又能促進(jìn)平菇菌絲的生長[3]。易允喻等采用D值計算法得出苦杏殼植物酸對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的最小抑菌濃度[4]。鑒于化學(xué)農(nóng)藥對環(huán)境和健康的危害，尋找純天然、安全、綠色的生物農(nóng)藥迫在眉睫，植物酸是一種純天然殺菌藥物，越來越受到人們重視。

煙曲霉菌是一種常見的病原真菌，對人、畜及作物均有嚴(yán)重危害，多采用化學(xué)藥劑防治[5-8]，尚未見關(guān)于植物酸的抑煙曲霉菌及其抑制機(jī)制的研究報道。隨著高通量測序技術(shù)的應(yīng)用，轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)已經(jīng)用于抑菌機(jī)制研究[9-10]。筆者所在實驗室在研究珊瑚狀猴頭菌新品種雪玉松茸（Hericium erinaceus）時，獲得1株內(nèi)生煙曲霉菌。從保證食品安全，尋找安全、抗真菌活性天然藥物的角度出發(fā)，本試驗研究植物酸對煙曲霉菌菌絲生長和分生孢子頂囊形態(tài)的影響，并通過轉(zhuǎn)錄組分析，對植物酸抑制煙曲霉菌的機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

植物酸由河北綠天生物科技有限責(zé)任公司提供;煙曲霉菌為筆者所在實驗室從雪玉松茸食用真菌中分離獲得，經(jīng)分子鑒定為煙曲霉菌（Aspergillus fumigatus）;陽性藥物氟康唑，購自藥店。

1.2 試驗方法

1.2.1 孢子懸液的制備 煙曲霉菌在35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，用含0.1% 吐溫80的生理鹽水沖洗培養(yǎng)基表面，經(jīng)無菌紗布過濾除去菌絲，7 000 r/min 離心2 min，棄上清，經(jīng)無菌生理鹽水洗2次后，離心棄上清，用生理鹽水重懸孢子，用血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)后，調(diào)整孢子懸液濃度為100萬～500萬CFU/mL，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 瓊脂稀釋培養(yǎng)法測定植物酸對煙曲霉的最小抑菌濃度 在PDA固體培養(yǎng)基中加入不同劑量的植物酸，濃度分別為5、10、15、20 μL/mL，待冷卻至室溫后倒平板，于平板中央注入5 μL孢子懸液，同時設(shè)立陽性對照組（加氟康唑）和空白對照組（加無菌水），均設(shè)置3個平行。35 ℃恒溫連續(xù)培養(yǎng)4 d，觀察并記錄菌落直徑，PDA固體培養(yǎng)基中無菌落生長的植物酸濃度即為最小抑菌濃度（MIC）。

1.2.3 植物酸對煙曲霉菌菌絲質(zhì)量的影響 采用PDA培養(yǎng)基進(jìn)行液體培養(yǎng)，加入植物酸，使其終濃度為1/2MIC，加入孢子懸液，以加無菌水的處理為空白對照組，加氟康唑的處理為陽性對照組，均設(shè)置3個平行。于35 ℃、130 r/min條件下進(jìn)行培養(yǎng)，觀察并記錄菌絲球生長情況及培養(yǎng)液顏色變化，培養(yǎng)4 d后，過濾菌絲用無菌水沖洗后，烘干至恒質(zhì)量，測量菌絲干質(zhì)量。

1.2.4 植物酸對煙曲霉菌分生孢子梗形態(tài)的影響 用牙簽挑取處理組與空白對照組菌絲于載玻片上，用乳酸酚棉藍(lán)染色后，置于普通光學(xué)顯微鏡下觀察，比較菌絲形態(tài)的變化。

1.2.5 轉(zhuǎn)錄組測序 Trizol法提取終濃度為1/2MIC的植物酸處理組及空白對照組煙曲霉菌總RNA，分別標(biāo)記為處理組1-1、處理組1-2、處理組1-3，對照組1-1、對照組1-2、對照組1-3（表1）。測定樣品濃度，質(zhì)檢合格后，送交深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，對差異表達(dá)基因（DEG）進(jìn)行基因的木體論（GO）功能及代謝路徑（Pathway）功能分析，分析樣品組間基因表達(dá)的差異。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，每組試驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度植物酸對煙曲霉菌的抑制作用

在培養(yǎng)基中分別加入5、10、15、20 μL/mL植物酸，以加氟康唑的處理為陽性對照組，以加無菌水的處理為空白對照組。35 ℃培養(yǎng)4 d后，測定煙曲霉菌菌落直徑。發(fā)現(xiàn)空白對照組的生長速度顯著（P<0.05）高于植物酸處理組，當(dāng)植物酸濃度為20 μL/mL時，煙曲霉菌生長完全受到抑制，則 20 μL/mL 為最小抑菌濃度（圖1）。

2.2 植物酸對煙曲霉菌菌絲質(zhì)量的影響

在液體培養(yǎng)基中， 加入終濃度為1/2MIC的植物酸，以加無菌水的處理為空白對照組，加氟康唑的處理為陽性對照組。接入孢子懸液，于35 ℃、130 r/min條件下培養(yǎng)4 d，測定菌絲干質(zhì)量，結(jié)果見表2。

由表2可知，植物酸處理組菌絲干質(zhì)量明顯低于空白對照組和陽性對照組，分別為空白對照組和陽性對照組的86%、9.4%，并且與對照組相比，植物酸處理組孢子萌發(fā)較晚，且其培養(yǎng)液及菌絲球顏色并未呈現(xiàn)對照組的黑褐色，表明植物酸抑制了煙曲霉菌的生長及色素的合成。

2.3 植物酸對煙曲霉菌菌絲及分生孢子梗形態(tài)的影響

由圖2可知，將加入5、10 μL/mL植物酸的處理組與對照組的煙曲霉菌用乳酸酚棉藍(lán)染色，顯微觀察煙曲霉菌的菌絲及孢子形態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)植物酸處理組與對照組存在明顯差異。對照組菌絲中分生孢子頭數(shù)量較多且孢子頂囊呈圓形產(chǎn)孢數(shù)量較多（圖2-A、圖2-B），植物酸處理組中分生孢子頭數(shù)量隨植物酸濃度的增加逐漸減少，10 μL/mL植物酸處理組孢子頂囊發(fā)育不完全（圖2-E、圖2-F）。

2.4 轉(zhuǎn)錄組分析

根據(jù)差異基因檢測結(jié)果，對其GO功能進(jìn)行分類和富集分析。GO分為生物學(xué)過程（biological process）、細(xì)胞組分（cellular component）和分子功能（molecular function）。結(jié)果顯示，在生物學(xué)過程中代謝過程（metabolic process）、細(xì)胞過程（cellular process）和單一生物過程（single-organism process）富集到較多的DEG; 在細(xì)胞組分中細(xì)胞（cell）、 細(xì)胞組分（cell part）、膜（membrane）、細(xì)胞器（organelle）、膜組成（membrane part）等富集到的DEG較多;在分子功能中富集到的DEG較多的是催化作用（catalytic activity）和結(jié)合作用（binding）（圖3）。

進(jìn)一步對GO功能對應(yīng)的差異基因上調(diào)、下調(diào)進(jìn)行分析。結(jié)果（圖4）顯示，顯著上調(diào)基因主要集中在細(xì)胞組分中的細(xì)胞（cell）、細(xì)胞組分（cell part）、細(xì)胞器（organelle）、細(xì)胞器組分（organelle part）和大分子復(fù)合物（macromolecular complex）;顯著下調(diào)基因主要集中在生物學(xué)過程中的代謝過程（metabolic process）、細(xì)胞過程（cellular process）和單一生物過程（single-organism process），以及分子功能中的催化作用（catalytic activity）、結(jié)合作用（binding）、轉(zhuǎn)運(yùn)活性（transporter activity）和核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性（nucleic acid binding transcription factor activity）。

根據(jù)差異基因檢測結(jié)果，對其進(jìn)行KEGG生物通路分類以及富集分析，通路分類結(jié)果詳見圖5，富集通路對應(yīng)的差異表達(dá)基因上調(diào)、下調(diào)詳見圖6。差異基因代謝通路主要包括細(xì)胞過程（cellular processes）、環(huán)境信息處理（environmental information processing）、遺傳信息處理（genetic information processing）、代謝（metabolism）、有機(jī)系統(tǒng)（organismal systems）。結(jié)果顯示，差異基因代謝通路主要集中在代謝過程，所涉及到的Unigene數(shù)目高達(dá)3648條。其次是遺傳信息處理，涉及885條Unigene。涉及上調(diào)基因數(shù)目較多的代謝通路主要包括氨基酸生物合成（biosynthesis of amino acids）、核糖體（ribosome）、氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）和氨酰tRNA生物合成（aminoacy-tRNA biosynthesis）。說明植物酸促使蛋白質(zhì)合成過程加強(qiáng)。涉及下調(diào)基因數(shù)目較多的代謝通路主要是代謝通路（metabolic pathways），其次是次級代謝產(chǎn)物的生物合成（biosynthesis of secondary metabolites）、抗生素生物合成（biosynthesis of antibiotics）以及星形孢菌素生物合成（staurosporine biosynthesis）。

3 討論與結(jié)論

植物酸是一種純天然殺菌藥物，對植物病原菌、霉菌和細(xì)菌均有很好的生長抑制活性[11-14]，本研究結(jié)果表明，植物酸能夠改變煙曲霉菌的菌絲形態(tài)，減少或抑制孢子的生成和產(chǎn)率，從而抑制煙曲霉菌的生長。應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對植物酸處理抑制煙曲霉菌生長的樣品進(jìn)行研究，差異表達(dá)基因GO功能分析結(jié)果顯示，涉及上調(diào)基因數(shù)目較多的代謝通路主要包括氨基酸生物合成、核糖體、氧化磷酸化和氨酰tRNA生物合成。推測可能是植物酸的有效成分導(dǎo)致蛋白質(zhì)受損，從而代償性地促進(jìn)煙曲霉菌蛋白質(zhì)的合成過程以滿足其生長需要。下調(diào)基因主要集中在生物學(xué)過程中的代謝過程、細(xì)胞過程和單一生物過程。涉及差異基因下調(diào)數(shù)目較多的生物通路主要集中在代謝通路、次級代謝產(chǎn)物的生物合成。推測植物酸中含有的酸類、酚類等活性物質(zhì)可能是通過滲透的方式進(jìn)入煙曲霉細(xì)胞內(nèi)，干擾這些信號通路及相關(guān)基因的表達(dá)，從而抑制煙曲霉生長。同時發(fā)現(xiàn)星形孢菌素生物合成通路中相關(guān)基因明顯下調(diào)，最終減少煙曲霉菌毒素的合成，這一結(jié)果解釋了加入植物酸液體培養(yǎng)煙曲霉菌時，色素量明顯下降的現(xiàn)象。

總之， 植物酸能抑制煙曲霉菌菌絲生長和分生孢子囊的形成，在煙曲霉生長過程中，植物酸通過干擾多個相關(guān)基因，致使多個信號通路受到影響，從而達(dá)到抑制煙曲霉菌的作用。植物酸的抑菌作用可能是乙酸、酚類和糠醛等多種成分共同作用的結(jié)果[15-17]，具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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