陸地棉脂肪酸去飽和酶基因GhFAD2-1的克隆與表達分析

文鳳 孫亮 劉峰

摘要：Δ12-脂肪酸去飽和酶基因FAD2-1是控制種子中單不飽和脂肪酸油酸（C18 ∶ 1）向多不飽和脂肪酸亞油酸（C18 ∶ 2）轉化的關鍵基因，其表達水平決定植物油的營養價值與氧化穩定性。棉花GhFAD2-1基因的深入研究有利于采用脂肪酸代謝基因工程技術對棉仁中脂肪酸成分進行定向修飾和改造。采用同源克隆技術獲得棉花品種新陸早33號的GhFAD2-1基因，該基因編碼區全長 1 158 bp，共編碼385個氨基酸;生物信息學分析結果表明，GhFAD2-1基因序列具有1個典型的FAD2結構域和1個FAD2-N端結構，其氨基酸序列與橄欖、芝麻、花生、油茶等作物的FAD2序列相似性較高，在75%～78%之間。利用qRT-PCR技術分析發現，GhFAD2-1基因的表達量隨著棉籽的發育呈先升高后降低的趨勢，開花后40 d達到其表達峰值。使用氣相色譜-質譜聯用儀（GC-MS）測定其脂肪酸組成，結果表明，開花后0～40 d，C18 ∶ 1含量/C18 ∶ 2含量與GhFAD2-1基因表達量變化趨勢相反。

關鍵詞：棉花;GhFAD2-1;脂肪酸;qRT-PCR;GC-MS

中圖分類號：Q785;S562.01?? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）12-0074-05

棉花是世界上最重要的纖維作物，同時也是重要的油料作物。棉籽脫殼后的棉仁中油脂含量為25%～39%[1]，是世界上次于棕櫚、大豆、油菜、油葵、花生的第六大植物油來源。2016年我國棉籽產量約為677.59萬t，棉籽油的產量約為110.00萬t，是我國主要食用植物油之一。

單不飽和脂肪酸油酸（C18 ∶ 1）和多不飽和脂肪酸亞油酸（C18 ∶ 2）是植物油中的主要脂肪酸組分，這2種脂肪酸組分含量在油料作物種子中的相對比例決定了食用油的營養價值與氧化穩定性[2]。多不飽和脂肪酸亞油酸在貯藏過程中易氧化變質，且多不飽和脂肪酸通過氫化作用可產生反式脂肪酸及其異構體。反式脂肪酸會刺激身體合成膽固醇，過多的膽固醇高于細胞代謝所需，導致膽固醇集聚在血管中，易引發心血管疾病[3]。單不飽和脂肪酸能降低對人體健康有害的低密度膽固醇（LDL）水平，且其穩定性較高，富含 C18 ∶ 1 的食用植物油可較長時間地保存，在高溫烹調時不易氧化變質[4]。因此，提高油酸的相對含量，增加食用植物油脂中油酸含量與亞油酸含量的比值，是油料作物品質改良的重要內容[5-8]。

在植物脂肪酸合成代謝過程中，Δ12-脂肪酸去飽和酶FAD2是催化油酸脫氫生成亞油酸的關鍵酶，其編碼基因FAD2的表達水平直接調控了植物中油酸與亞油酸的相對含量與比例[9]。目前FAD2基因已從大豆（Glycine max）、玉米（Zea mays）、花生（Arachis hypogaea）、棉花（Gossypium hirsutum）、油葵（Helianthus annuus）、油菜（Brassica napus）和橄欖（Olea europaea）等多種植物中分離得到[10-15]。然而，目前關于棉花、大豆、油菜、花生等作物種子特異表達FAD2-1基因的調控機制卻鮮有報道。研究種子FAD2-1基因的時空表達調控模式以及脂肪酸組分形成的生理學機制，是有效定向調控種子中油酸組分含量的前提。本研究于2016—2017年在石河子大學棉花研究所和綠洲生態實驗室進行試驗，以新疆石河子棉區栽培種新陸早33號為材料，克隆其種子脂肪酸去飽和酶基因GhFAD2-1，并對該基因編碼蛋白進行序列分析;利用qRT-PCR檢測GhFAD2-1在種子發育過程中的表達情況;同時用氣相色譜-質譜聯用儀（GC-MS）分析種子發育過程中的脂肪酸組分，以期為進一步研究GhFAD2-1基因的調控機制、改良棉籽油的品質奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株、質粒及主要試劑

陸地棉（Gossypium hirsutum）品種新陸早33號、大腸桿菌菌株Escherichia coli XL1-Blue均由筆者所在實驗室保存。Ex Taq DNA聚合酶、限制性內切酶、DNA Marker等購自寶生物工程（大連）有限公司。普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（DP209）、植物總RNA提取試劑盒（DP437，離心柱型）等購自天根生化科技（北京）有限公司。第1鏈反轉錄試劑盒（PrimeScriptTM 1st strand cDNA Synthesis Kit）、克隆載體 pGEM-T easy vector和SYBR Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）等購自寶日醫生物技術（北京）有限公司（TaKaRa）。

1.2 GhFAD2-1基因的克隆

取新陸早33號花后35 d的棉花種子，去除外層軟殼后，將棉仁在研缽中用液氮冷激后快速研磨，將粉末快速裝入RNase-free的離心管中，保證樣品不溶解，并讓液氮揮發，采用植物總RNA提取試劑盒（DP437，離心柱型）提取總RNA，利用PrimeScriptTM 1st strand cDNA Synthesis Kit將1 μg總RNA反轉錄成cDNA。利用已知的FAD2-1基因序列信息（GenBank：HQ259410.1），設計特異性引物，上游：5′-ATGGGTGCCGGTGGTAGGA-3′，下游：5′-TTAGAACTTGTTACGATACC-3′。特異性引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。以反轉錄總RNA獲得的cDNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應條件為：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35個循環;72 ℃ 10 min。目標條帶回收步驟按照普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（DP209）的說明書進行。利用克隆載體連接試劑盒將回收片段連接到pGEM-T easy vector上，獲得pGEM-T-FAD2-1。轉化E.coli XL1-Blue，篩選抗氨芐青霉素的菌落，并進行菌落PCR鑒定和測序。