大白菜ENT基因家族的鑒定與生物信息學分析

龐文玉 王安 楊寶誼

摘要：核苷轉運蛋白（nucleoside transporter，ENT）是一類具有跨膜運輸核苷和核苷類似物的功能蛋白。為深入研究大白菜ENT基因家族的功能，利用生物信息學方法對大白菜基因組中的ENT基因家族成員進行鑒定，并對其基因組信息、蛋白生理生化特征、基因結構、保守結構域、系統進化樹等方面進行了研究。結果表明，在大白菜基因組中共鑒定到12個ENT基因，通過系統發育樹分析，可以將12個ENT基因分為2類;對大白菜ENT蛋白氨基酸序列多重比對和蛋白跨膜域的分析表明，BrENT蛋白存在11個跨膜域，為跨膜蛋白;通過MEME軟件對大白菜ENT蛋白motif的預測還發現了14個比較保守的motif。染色體分析表明，ENT基因在大白菜10條染色體上不均勻分布，而且存在明顯的串聯重復現象，推測串聯復制是ENT基因家族基因擴增的主要方式，研究結果為在基因組范圍內研究ENT基因的功能奠定了基礎。

關鍵詞：大白菜;核苷轉運蛋白;基因家族;生物信息學

中圖分類號： S634.101? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）12-0052-05

核苷轉運蛋白是一類具有跨膜運輸核苷和核苷類似物的功能蛋白，被轉運的核苷在核苷酸合成代謝的補救途徑中發揮重要作用。核苷轉運蛋白可分為擴散型的核苷轉運蛋白（equilibrative nucleoside transporter，ENT）和富集型的核苷轉運蛋白（concentrative nucleoside transported，CNT）2種類型。其中ENT在生物體內的分布非常廣泛，ENT家族被克隆的首個成員是hENT1，其cDNA是1996年從人胎盤中克隆得到的[1]。目前，在哺乳動物、細菌、酵母、寄生蟲和植物中均發現并鑒定到了ENT[2]。由于核苷轉運蛋白與癌癥、神經和心血管病的治療，寄生蟲病的防治以及抗病毒、人體保健等方面密切相關，因此在動物中得到深入而廣泛的研究[3-4]。

植物核苷轉運蛋白的研究還僅限于模式植物擬南芥和水稻中。李劍首先從擬南芥幼苗中克隆到核苷轉運蛋白基因AtENT1，并對其表達模式進行了研究[5]。結果表明AtENT1在擬南芥根、莖、葉、花序軸和花等器官中均有較強表達，且生殖生長階段表達水平高于營養生長階段[5]。隨后對核苷轉運功能的研究表明，AtENT1具有轉運腺苷和尿苷的能力，首次證實了植物中核苷轉運蛋白的轉運功能[6]。Li等又報道了AtENT3的轉運活性，并對AtENT1、AtENT2、AtENT3、AtENT4、AtENT6、AtENT7和AtENT8進行了研究與分析[7]。Wormit等利用酵母細胞研究了AtENT4、AtENT6、AtENT7和AtENT8的生化功能，發現AtENT4、AtENT6和AtENT7具有廣泛的底物選擇性，既能轉運嘌呤類核苷，也能轉運嘧啶類核苷[8]。對水稻核苷轉運蛋白的研究則表明OsENT2也具有核苷轉運蛋白的功能[9]。另有研究表明，植物核苷轉運蛋白還具有轉運細胞分裂素的能力[9-12]，這是繼生長素轉運蛋白PIN家族后發現的第2類植物激素轉運蛋白。對植物核苷轉運蛋白基因表達模式的研究表明，核苷轉運蛋白基因呈現廣譜表達性[9-11，13-15]，但是關于植物核苷轉運蛋白生物學功能的研究依然比較匱乏，僅有報道表明擬南芥AtENT1通過核苷酸代謝途徑影響花粉萌發與營養生長過程[13]。

核苷酸的挽救途徑是植物適應外界環境的一條重要代謝途徑，在植物體內廣泛存在，并參與了多種生理過程，如胚成熟和萌發，體外器官發生，打破休眠，果實成熟，貯藏器官發育與發芽，葉片衰老，植物組織培養中細胞的分裂、分化和調節以及植物對外界環境的反映等，對植物的生長發育具有重要意義[16]。因此，通過對植物ENT的研究，可為改善作物抗逆性、提高營養利用效率和促進養分的合理分配提供參考依據。

大白菜是我國北方乃至東南亞地區的重要蔬菜作物，南北各地均有栽培，也是我國種植面積最大的蔬菜作物。目前關于大白菜ENT（BrENT）的研究幾乎是一片空白。大白菜（栽培品種Chiifu-401-42）全基因組測序的完成使得對大白菜中相關基因家族的鑒定和功能分析成為可能。對BrENTs的研究有助于深入認識BrENTs家族成員，了解BrENTs在種子萌發、葉片衰老、營養物質分配和再利用以及抗逆性等過程中的作用，因此，開展BrENTs的研究具有重要意義。本研究利用生物信息學方法對大白菜ENT基因家族成員進行了鑒定和基因組注釋，并分析了其基因結構和保守域，以期為進一步研究BrENTs功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 大白菜ENT基因家族成員的鑒定

首先，利用擬南芥ENT蛋白的氨基酸序列在大白菜數據庫（http：//brassicadb.org/brad/）中進行Blast P比對篩選候選蛋白。利用搜索到的ENT蛋白的氨基酸序列對大白菜基因組數據庫進行二次Blast P比對搜索。最后，利用Pfam數據庫、SMART數據庫和NCBI的保守域數據庫分析候選蛋白的保守域以驗證ENT蛋白鑒定的準確性。

1.2 大白菜ENT基因的基因組信息和染色體定位

通過大白菜基因組數據庫獲得ENT基因的序列和基因組注釋信息，并根據ENT基因在染色體上的位置和染色體的長度將ENT基因定位到對應染色體上。

1.3 大白菜ENT蛋白的生理生化分析

通過Compute pI/Mwsoftware （http：//www.expasy.ch/ tools/pi_tool.html）預測ENT蛋白的分子量和等電點[17]。通過TargetP軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP）進行亞細胞定位分析[18]。

1.4 大白菜ENT基因的基因結構、保守域和系統進化樹分析

GSDS網站（http：//gsds1.cbi.pku.edu.cn/）[19]用來繪制ENT基因的外顯子-內含子結構圖。DNAman軟件用于對ENT蛋白氨基酸序列進行多重比對和跨膜域的預測。MEME網站（http：//meme.sdsc.edu/meme/meme.html）[20]用來預測ENT蛋白氨基酸序列中的保守motif。利用MEGA 5.0軟件，使用鄰接法（neighbor-joining method）構建系統進化樹，采用泊松校正，成對刪除和1 000次重復等建樹參數[21]。

2 結果與分析

2.1 大白菜ENT基因家族的鑒定和注釋

根據擬南芥ENT蛋白的氨基酸序列，對大白菜數據庫進行Blast P搜索，最終在大白菜基因組中鑒定到12個ENT基因家族成員。如表1所示，這12個ENT基因長度在538～1 279 bp，編碼179～426個氨基酸，蛋白分子量在19.6～56.0 ku 之間。其中，BrENT2的開放閱讀框和編碼的氨基酸序列長度最長，BrENT12的開放閱讀框和編碼的氨基酸序列長度最短。等電點（pl）在5.54～9.35之間，BrENT12等電點最低，BrENT3等電點最高。根據TargetP軟件對ENT蛋白亞細胞定位的預測表明除BrENT11和BrENT12分別定位在細胞核和液泡中，其余絕大多數ENT蛋白定位在細胞質膜上（BrENT1～BrENT10）。

對大白菜ENT基因染色體定位（圖1）的研究表明，ENT家族成員在大白菜的10條染色體上呈現明顯的不均勻分布，其中9號染色體上有6個ENT基因，1號染色體上有2個ENT基因，2、5、8和10號染色體上均有1個ENT基因，在其他染色體上則沒有分布。另外，ENT基因存在明顯的串聯重復現象，并在染色體上呈現2個串聯重復基因簇，其中BrENT8和BrENT9為一對串聯重復基因，在1號染色體上形成一個串聯重復基因簇，BrENT1、BrENT3、BrENT5、BrENT6和BrENT7則在9號染色體上形成一個較大的串聯重復基因簇。

2.2 大白菜ENT基因結構分析

為明確大白菜ENT基因結構，根據大白菜基因組信息獲取了每一個ENT基因的基因組序列和CDS序列信息并繪制外顯子-內含子結構圖（圖2），結果表明大白菜ENT基因含有1～7個數量不等的內含子，其中BrENT10和BrENT11均含有1個內含子，BrENT12含有2個內含子，BrENT4含有4個內含子，BrENT7、BrENT8、BrENT9含有6個內含子，而BrENT1、BrENT2、BrENT3、BrENT5、BrENT6則含有7個內含子。另外，通過對基因結構圖和基因進化樹的比較分析發現基因的親緣關系越近，其基因結構和內含子數量也越相似。

2.3 大白菜ENT蛋白的氨基酸序列比對和保守域分析

為研究大白菜ENT蛋白的保守結構域，使用DNAman軟件對大白菜ENT蛋白的氨基酸序列進行多重比對（圖3）。結果表明大白菜ENT蛋白的氨基酸序列比較保守，并含有ENT蛋白家族典型的11個跨膜域（圖4）[7]。推測大白菜ENT蛋白是跨膜蛋白，這與上述對大白菜ENT蛋白在細胞質膜上的亞細胞定位結果一致。另外，利用MEME軟件對大白菜ENT蛋白保守motif的預測分析，鑒定到了14個比較保守的motif（motif 1～14）（圖5）。

2.4 大白菜ENT基因的系統發育分析

為分析大白菜ENT基因的親緣關系和進化模式，使用MEGA 5.0軟件對選取的大白菜及其近緣模式植物擬南芥ENT蛋白的氨基酸序列構建了NJ進化樹。結果表明，大白菜和擬南芥ENT基因可以被聚類成兩大分支，Clade Ⅰ和Clade Ⅱ。Clade Ⅰ包含9個BrENT基因，又分為4個亞分支，其中Clade Ⅰ-a是比較大的亞分支，包含BrENT1～BrENT7 7個基因，Clade Ⅰ-b和Clade Ⅰ-c分別含有1個BrENT基因，而Clade Ⅰ-d只包含1個擬南芥ENT基因AtENT2。Clade Ⅱ包含3個BrENT基因，可以進一步分成CladeⅡ-a和Clade Ⅱ-b 2個分支，其中BrENT10位于Clade Ⅱ-a，而BrENT11和BrENT12位于Clade Ⅱ-b（圖6）。

3 結論與討論

本研究根據擬南芥ENT蛋白的氨基酸序列，通過對大白菜數據庫進行Blast P搜索，最終在大白菜基因組中鑒定到12個ENT基因家族成員，并對其家族成員進行基因和蛋白特征分析、基因結構分析、保守域分析以及系統發育分析，為后期大白菜ENT基因功能研究提供了基礎。

基因擴增是基因組進化最主要的驅動力之一，是產生具有新功能的基因和進化出新物種的主要分子機制之一。基因可以通過多種方式進行擴增，包括全基因組復制、串連復制、片段復制和逆轉座復制等。本研究鑒定到12個大白菜ENT基因，而擬南芥基因組中共有8個ENT基因，推測大白菜ENT基因家族出現了基因擴增現象。值得注意的是在這12個大白菜ENT基因中有8個基因分布在2個串聯重復基因簇中，以串聯重復的形式存在，表明串聯復制是ENT基因家族基因擴增的主要方式。BrENT8和BrENT9是一對串聯重復基因，其中BrENT9是AtENT7的同源基因，而在擬南芥中沒有發現BrENT8的同源基因，推測BrENT9以串連復制的形式發生后，在進化過程中又發生了比較明顯的變異，但是其基因分化機制及具體的基因功能有待深入研究。

大白菜和擬南芥分化之前出現過3次全基因組復制事件（α、β、γ復制事件），分化發生之后大白菜基因組又發生了全基因組三倍化事件[22]。由于基因組加倍后，會伴隨著發生染色體重排，基因丟失等現象。大白菜ENT基因家族成員數量只有擬南芥的1.5倍，說明伴隨著大白菜基因組三倍化事件也產生了大量的基因丟失事件，尤其是在大白菜基因組中沒有鑒定到AtENT2的同源基因，其基因丟失具體的發生機制仍有待進一步研究。

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