聚合物涂層在毛細管電泳分離蛋白中的研究進展

陳麗娟，閆葉寒，朱海錕，Muhammad Atif

(1.皖西學院 材料與化工學院，安徽 六安 237012；2.中國科學技術大學 化學與材料科學學院，安徽 合肥 230026)

毛細管電泳(Capillary electrophoresis,CE)是20世紀80年代發展起來的一種新型分析技術，具有分析時間短，分離效率高，樣品消耗量少等優點，常用于復雜樣品的分析研究[1-3]，在分離科學發展史上具有劃時代意義[4-5]。CE的工作原理是：以高壓電場為驅動力，毛細管為分離通道，根據被分析物各組分間淌度和遷移時間分配上的不同實現分離。在CE分析中，所用的毛細管一般是石英玻璃材質，毛細管內壁硅羥基(Si—OH)的覆蓋密度約為4.5/nm2[6]，CE分離時的背景緩沖液pH值范圍較寬(pH 3.0～9.0)，當背景緩沖液的pH值超過毛細管內壁Si—OH的等電點(pI=2～3)時，Si—OH將會發生解離，離子化為帶負電荷的硅氧基(Si—O-)，這種帶負電荷的毛細管內表面將導致緩沖液中陽離子吸附到內壁表面形成雙電層，并在電場作用下形成電滲流(EOF)[7]；另一方面，在對生物樣品如蛋白質的分離過程中，帶正電荷的堿性蛋白質與帶負電荷的毛細管內壁之間存在強烈的靜電相互作用，蛋白質一旦吸附在毛細管內壁即會出現信號峰展寬、拖尾，甚至難以檢測出信號峰的現象[8]。為解決這一問題，目前的研究熱點是在毛細管內壁涂覆上一層聚合物抗污涂層(抗蛋白質吸附，抗菌功能的涂層)，以有效阻抗蛋白質的吸附，減弱蛋白質與毛細管內壁的相互作用，同時有效抑制或調控EOF，在很大程度上優化CE的分離效果。根據聚合物涂層與毛細管內壁之間結合方式的不同，可將毛細管分為動態涂層毛細管和靜態涂層毛細管[9]，示意圖見圖1。

圖1 動態涂層(A)及靜態涂層(B)示意圖[10]Fig.1 Dynamic(A) and static(B) capillary coatings[10]

1 聚合物抗污涂層材料

2 毛細管動態涂層

毛細管動態涂層通常是在CE運行的背景緩沖液中加入水溶性抗污聚合物來實現，這些聚合物可以優先吸附在毛細管內壁，快速建立吸附-解吸平衡，實現對毛細管內壁的有效覆蓋，從而調控EOF和減弱蛋白質在毛細管內壁的吸附。所加入的水溶性聚合物可以是中性聚合物PEG、PVA、PVP、羥乙基纖維素等，也可以是陽離子型的聚合物。這些水溶性聚合物的加入能夠在一定的pH值范圍內有效抑制或調控電滲流，提高蛋白質的分離效率以及分離的穩定性。Zhao等[33]合成了一系列季胺化的纖維素(Quaternized celluloses,QC)，并將其作為陽離子型的聚合物添加入CE背景緩沖液中，在添加劑量為3 μg/mL時獲得穩定的反向電滲流。他們進一步對QC的分子量、陽離子化程度以及背景緩沖液pH值等進行了研究，發現QC動態涂層對蛋白質的分離時間依賴于QC的分子量和陽離子化程度。該涂層能夠在25 min內，于pH 5.0～8.0區間實現5種蛋白質(溶菌酶、核糖核酸酶A、細胞色素c、牛胰蛋白酶抑制劑、α-凝乳蛋白酶原A)混合樣品的有效分離。

表1 文中所述的毛細管內壁修飾聚合物涂層材料、分離樣品及分離效率Table 1 The polymer coating materials used,the separating sample and the separating efficiency described in the paper

static coatingsⅠlists the noncovalent polymer coatings;static coatings Ⅱlists the covalent polymer coatings;static coatings Ⅲ lists polydopamine based polymer coatings

近些年來發展了一種新型的聚合物離子液體動態涂層材料，所謂聚合物離子液體(PILs)是指集離子液體與聚合物結構于一身的一類聚合物材料，通?？赏ㄟ^小分子離子液體單體的聚合制備得到[34-35]。典型的基于N-乙烯基咪唑鹽單體的聚合反應制備離子液體的反應示意圖如圖2所示。該種結構的聚合物離子液體由于帶有正電荷，能夠與帶負電荷的毛細管內壁結合，從而使得毛細管內壁涂敷上一層帶正電荷的聚合物涂層，因此會呈現出反向的電滲流特性。

圖2 N-乙烯基咪唑鹽單體的聚合反應制備聚合物離子液體[32]Fig.2 General synthetic route to PILs from N-vinylimidazolium-based IL monomers[32]

Li等[36]利用聚合物離子液體的這一特性制備得到了一種動態涂層毛細管，他們合成了一種陽離子型聚合物離子液體——聚(1-乙烯基-3-丁基咪唑溴)(Poly(1-vinyl-3-butylimidazolium)bromide)，并發現該類聚合物離子液體動態涂層在pH 3.0～9.0范圍內呈現出良好穩定的反向EOF[37]，利用該特性能夠有效抑制分析物在毛細管內壁的吸附，即使是堿性蛋白混合樣品也能夠實現有效分離，蛋白質峰的分離效率甚至達到247 000 ～540 000 plates/m，3次連續分離遷移時間的平均標準偏差低于0.37%[38]。毛細管動態涂層具有可再生的優點，涂層制備方法簡單，但是相較于毛細管靜態涂層，其對蛋白質的分離效率以及涂層的穩定性能均有待進一步優化。

3 毛細管靜態涂層

毛細管靜態涂層通常是CE運行之前就已經在毛細管內壁修飾上的聚合物涂層材料，可直接用于電泳分析，CE運行背景緩沖液中無需再添加其他物質。較動態涂層而言，該類型涂層對蛋白質的分離效率，及其自身穩定性均有所提高，因而也是目前的研究熱點[39]。毛細管靜態涂層根據聚合物材料與毛細管內壁結合形式不同又可分為非共價鍵涂層和共價鍵涂層兩大類。

3.1 非共價鍵涂層

涂層材料通過與毛細管內壁硅羥基之間的氫鍵、離子鍵或者疏水相互作用等方式結合而得到的涂層統稱為非共價鍵涂層或半永久性涂層，毛細管內非共價鍵涂層的制備方法一般較為簡單易行，且具有涂層可再生的優點[40-41]。Yang 等[42]通過將羥乙基纖維素部分陽離子化(Cationized hydroxyethylcellulose,cat-HEC)制備了一種陽離子涂層，并成功用于3種堿性蛋白質(溶菌酶、核糖核酸酶A、細胞色素c)混合樣品的有效分離。Shi等[43]通過在羥乙基纖維素骨架接枝聚乙二醇(HEC-g-PEG)，使羥乙基纖維素與毛細管內壁結合，再利用PEG的抗蛋白質吸附性能制備得到抗污涂層管。該聚合物涂層在較寬的pH值和溫度范圍內穩定，能夠實現4種堿性混合蛋白質和酸性、中性、堿性6種蛋白質混合樣品的有效分離，其中HEC-g-PEG750 涂層管的分離效率和分離重現性最好。Xing等[44]通過原子轉移自由基聚合(ATRP)法合成了一種四臂聚合物PEG3-PDMA，其中三臂是具有抗污能力的PEG，另外一臂為具有涂覆能力的聚(N,N-二甲基丙烯酰胺)(PDMA)，該聚合物形成的涂層管能夠有效抑制電滲流，實現細胞色素c、溶菌酶以及核糖核酸酶A混合物的有效分離。Xu等[45]通過ATRP的方法制備了一種三嵌段聚合物——聚(N,N-二甲基丙烯酰胺)-b-聚乙二醇-b-聚(N,N-二甲基丙烯酰胺)(PDMA-b-PEG-b-PDMA)，該聚合物對毛細管內壁具有很好的涂覆效果，尤其是其中的PDMA鏈段可與毛細管內壁通過疏水相互作用結合，是一種有效的涂層材料，該涂層毛細管可以實現堿性蛋白質混合樣品的有效分離以及酸、中、堿性3種類型蛋白質混合樣品的有效分離。朱小璽等[46]通過ATRP法合成了聚(4-乙烯基吡啶)-b-聚乙二醇-b-聚(4-乙烯基吡啶)三嵌段聚合物(P4VP-b-PEG-b-P4VP)，該三嵌段聚合物中的P4VP部分可以與毛細管內壁的硅羥基通過發生物理相互作用(靜電相互作用)制備物理涂層管，并且該涂層具有pH值敏感性，可以通過調節緩沖液的酸堿度來調控EOF以及優化對堿性蛋白質的分離度和分離時間。Cao等[47]制備了一系列的離子型抗污聚合物，并通過物理涂敷的方法制備了相應的物理涂層毛細管，該毛細管呈現出非常優異的蛋白質分離性能。他們通過普通自由基聚合的方法制備了羥乙基纖維素接枝聚(甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯)(HEC-g-PDMAEMA)，通過ATRP法制備了聚(甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯)-b-聚乙二醇-b-聚(甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯)(PDMAEMA-b-PEG-b-PDMAEMA)三嵌段共聚物，并對該聚合物上PDMAEMA鏈段上的叔胺季銨化處理得到陽離子型抗污聚合物[48]，該聚合物可以通過靜電相互作用以及氫鍵作用結合在毛細管內壁。他們還通過可逆加成斷裂鏈轉移(RAFT)反應合成了甲基丙烯酸甲酯磺基甜菜堿(SBMA)與N,N-二甲基丙烯酰胺(DMA)的無規共聚物(poly(DMA-co-SBMA))，該聚合物上的DMA部分具有很好的自涂敷性能，SBMA部分具有很好的抗蛋白質吸附性，該種類型的毛細管抗污涂層可以在10 min內實現對4種堿性蛋白的快速分離，分離效率最高可達1 509 000 plates/m[49]。

3.2 共價鍵涂層

涂層材料與毛細管內壁之間通過共價鍵結合而形成的涂層統稱為共價鍵涂層。共價鍵涂層具有良好的穩定性，其涂層技術一般包括毛細管的預處理、活性基團的引入、目標涂層聚合物的引入等多個步驟，涂層制備工藝較為繁瑣，涉及的化學反應多，耗時長，而且有可能使涂層制備的重復性變差，但是這并沒有阻礙共價鍵涂層的發展。Razunguzwa等[50]通過PEG大分子硅烷偶聯劑與毛細管內壁的反應制備了共價鍵合的PEG涂層，該涂層能夠用于牛血清蛋白、細胞色素c、溶菌酶以及肌紅蛋白混合樣品的有效分離。Xu等[51]通過硅烷化試劑，首先在毛細管內壁引入氨基官能團，然后使其與戊二醛反應引入醛基官能團，最后利用PVA與醛基間的縮醛化反應，將PVA以共價鍵合的方式結合在毛細管內壁制備得到共價鍵合涂層，該涂層在pH 3.0～10.0的區間內可有效抑制EOF，并且能夠在pH 3.0～5.0區間實現陽離子型蛋白質(包括：細胞色素c、溶菌酶、胰凝乳蛋白酶原)以及pH 10.0時陰離子型蛋白質(包括：肌紅蛋白、胰蛋白酶抑制劑)的有效分離，該共價鍵合涂層在連續分離100次后，遷移時間的相對標準偏差(RSD)仍小于0.9%。以上共價鍵合法制備的涂層結合了PVA和PEG的抗蛋白質吸附性能以及共價鍵的穩定性能，故而呈現出優異的分離性能和穩定性能，但是涂層的制備方法過于復雜。此外，常用于毛細管內壁修飾的硅烷偶聯劑多是有毒且濕度敏感性物質，在使用的過程中不可避免會引起環境問題以及涂層管質量問題。如何將共價鍵涂層的優良性能與簡易的涂層制備技術相結合是當下的研究熱點。

以上介紹的是基于熱交聯方式制備的共價鍵涂層毛細管，近年來，紫外光交聯也為共價鍵合毛細管的研制提供了新的研究思路。該方法通過制備一種光敏性重氮聚合物，利用重氮聚合物上的正電荷與毛細管內壁硅氧基的負電荷之間的靜電相互作用(pH>3.0)或氫鍵作用將其吸附在毛細管內壁[54]，然后再利用重氮聚合物上的正電荷與帶有負電荷的抗污聚合物間的相互作用，將抗污聚合物通過靜電相互作用結合在毛細管內壁。在此過程中，光敏性的重氮聚合物主要起到中間層的作用，最后該靜電吸附涂層在紫外光下進行交聯，離子鍵轉化為共價鍵得到共價鍵涂層，該類涂層毛細管呈現出良好的化學穩定性和蛋白質分離性能。Yu等在這一領域做了大量工作，典型的基于光敏性重氮樹脂(DR)與環糊精樹枝狀大分子(CD-dendrimer)制備共價鍵涂層毛細管的流程如圖3 所示[55]。他們基于分子間的靜電相互作用逐步將DR和CD-dendrimer涂敷于毛細管內壁，然后在紫外光的交聯作用下離子鍵轉化為共價鍵，從而構建了DR/CD-dendrimer共價鍵涂層。該種涂層能夠實現堿性蛋白質的有效分離，5次連續分離遷移時間的RSD<2.5%，連續60次分離遷移時間的RSD<3.0%，3根毛細管分離遷移時間的RSD<3.0%。實驗結果表明：該涂層管呈現出較好的穩定性能，方法具有可行性。此外，他們還基于毛細管內壁與DR間的靜電相互作用以及DR與聚甘油樹枝狀大分子(PG-dendrimer)間的靜電相互作用制備得到了DR/PG-dendrimer共價鍵涂層毛細管。該種涂層管呈現出優異的穩定性能和分離效率，在20 min時間內能夠實現溶菌酶、牛血清白蛋白、肌紅蛋白以及核糖核酸酶A的有效分離，并且連續分離280次后的遷移時間和分離效率均無明顯改變[56]。最近，他們通過ATRP法合成了聚乙烯醇與聚苯乙烯的兩嵌段聚合物poly(VA-b-St)，通過在苯乙烯對位上引入重氮結構，制備了重氮化聚乙烯醇-b-苯乙烯(diazo-poly(VA-b-St))。該重氮聚合物同樣可以通過靜電自組裝以及紫外光致離子鍵轉化共價鍵制備diazo-poly(VA-b-St)涂層毛細管，該涂層管能夠實現溶菌酶、牛血清白蛋白及核糖核酸酶A混合樣品的有效分離[57]。以上新型共價鍵涂層的制備方法為涂層毛細管的研制提供了新思路，也為毛細管電泳的應用開拓了新領域。近些年發展起來的基于多巴胺/聚多巴胺生物粘合劑制備的一系列聚合物涂層毛細管同樣在毛細管分離領域具有很大的應用價值。

圖3 制備重氮樹脂/環糊精樹枝狀大分子共價鍵合涂層管示意圖[55]Fig.3 Schematic illustration of preparation process of covalently bonded DR/CD-dendrimer coatings on capillary surface[55]

3.3 聚多巴胺涂層

自2007年被報道至今，仿生貽貝類聚多巴胺涂層在各領域得到了廣泛應用[58-59]。聚多巴胺涂層作為一種萬能生物粘合劑，可以吸附于各種材料表面，并且聚多巴胺表面由于苯醌等基團的存在，可以與帶有活潑氫的氨基/巰基發生邁克爾加成/希夫堿反應，從而可通過對聚多巴胺涂層進行二次修飾制備各種功能的涂層表面，此方法稱為聚多巴胺的二步涂敷法。此外基于多巴胺與功能性共聚物的一步共混沉積制備功能性表面的方法也得到了廣泛應用[60-63]。由于聚多巴胺與基底之間的黏附機理比較復雜，至今尚無公認的說法，因此，基于多巴胺/聚多巴胺修飾的涂層管另歸一類進行討論[64]。

圖4 PMOXA-EI與DA一步共混制備抗污涂層管及用于奶粉中三聚氰胺的檢測[74]Fig.4 Schematic illustration of coatings deposited on the inner-wall of fused-silica capillary using DA and PMOXA-EI[74]

基于多巴胺/聚多巴胺涂層制備的聚合物涂層毛細管還有很多種類[76]，它們均表現出較好的分離穩定性和分離效率，但是多巴胺/聚多巴胺與毛細管內壁的結合形式以及與聚合物之間的相互作用機理解釋至今還處于研究中，有待進一步闡述和深入研究應用[77-80]。

4 總結與展望

在CE分析領域，毛細管柱是核心，涂層毛細管的好壞直接關系到電泳分離的穩定性以及分離效率，所以更好地完善毛細管涂層能夠進一步推動毛細管電泳的發展，結合以上毛細管涂層的研究進展，一種好的涂層技術應該是簡單易行，環保綠色的。此外，一種普適性的聚合物涂層材料應該具有以下特點：(1)聚合物具有一定的親水性，能夠形成水合層，抑制目標分析物在毛細管內壁的吸附；(2)聚合物能夠在毛細管內壁形成均勻的涂層,有效屏蔽硅羥基，調控電滲流；(3)聚合物涂層的pH值適應性強，能夠在較寬的pH值范圍內維持穩定。