通過式固相萃取凈化/超高效液相色譜-串聯質譜法測定黃瓜、番茄及豇豆中的克百威與涕滅威殘留

覃國新,勞水兵,莫仁甫,閆飛燕,王 靜,金茂俊,何 潔,周其峰,楊玉霞,王海軍,陳 偉

(1.廣西壯族自治區農業科學院 農產品質量安全與檢測技術研究所,農業部甘蔗品質監督檢驗測試中心(南寧),廣西 南寧 530007；2.中國農業科學院 農業質量標準與檢測技術研究所,農業部農產品質量安全重點實驗室,北京 100081)

黃瓜、番茄和豇豆是人們日常生活中常見的蔬菜,具有生長期較短、市場流通快等特點,但容易受霜霉病、灰霉病、根腐病、灰色疫等病蟲的危害,雖然殺蟲劑、殺菌劑等農藥的使用在一定程度上防治了病蟲害,并提高了蔬菜產量,但也造成了蔬菜中的農藥殘留。克百威、涕滅威屬于氨基甲酸酯類農藥,常用作殺蟲劑和殺菌劑而被廣泛應用[1-3],雖然國家已禁止使用克百威和涕滅威,但其作為高效廣譜的殺蟲劑仍廣泛用于農業生產中[4-5],克百威和涕滅威在自然界中降解比較快,在農作物中主要以3-羥基克百威、涕滅威砜、涕滅威亞砜等代謝產物形式存在,對人類健康和生態環境勢必會造成嚴重的毒害[6-7]。因此,需同時監測農藥母體及其代謝物的殘留量,才能達到有效監控食品安全的目的。

我國國家強制性標準《食品中農藥最大殘留限量》(GB 2763-2016)[8]規定瓜類和豆類蔬菜中克百威及3-羥基克百威之和的最大殘留量為0.02 mg/kg,涕滅威及涕滅威砜、涕滅威亞砜之和的最大殘留量為0.03 mg/kg。已有檢測克百威和涕滅威的方法主要為氣相色譜法[9]、氣相色譜-串聯質譜法[10-11]、液相色譜[12-13]、液相色譜-串聯質譜法[14-15]等。但這些方法的樣品前處理需多次提取、固相萃取凈化、衍生化等操作,操作繁瑣、費時,很難滿足大批樣品的快速、高通量檢測需求。

目前,蔬菜中克百威等氨基甲酸酯類農藥殘留一般采用固相萃取或QuEChERS方法進行前處理,高效液相色譜-串聯質譜法(HPLC-MS/MS)進行檢測[16-17]；而采用通過式固相萃取凈化進行樣品前處理的研究僅有幾篇文獻報道,如勵炯等采用通過式固相萃取技術,提取液使用Oasis PRiME HLB固相萃取柱通過式凈化,建立了特殊醫學用途配方食品中13種非法添加降糖類化學成分的分析方法,方法無需復雜的樣品前處理,不僅有效降低了基質效應,而且提高了分析的靈敏度和選擇性[18]；高潔等采用新型通過式固相萃取技術結合超高效液相色譜-串聯質譜法,建立了同時測定豬肉中52種同化激素的快速分析方法,樣品經乙腈渦旋提取后,用Oasis PRiME HLB固相萃取柱通過式凈化,多反應監測模式檢測,不僅操作簡單,分析速度快；而且靈敏度高,準確可靠[19]。可見,采用通過式固相萃取凈化技術,大大縮短了樣品前處理時間,從而有效提高檢測效率。但目前尚未見采用通過式固相萃取技術對黃瓜、番茄和豇豆等蔬菜中克百威和涕滅威及其代謝物殘留進行前處理的研究報道。因此，本研究采用乙腈和QuEChERS提取鹽包提取,經Oasis PRiME HLB柱通過式固相萃取凈化,超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)法測定,建立了同時檢測黃瓜、番茄和豇豆中克百威、3-羥基克百威、涕滅威、涕滅威砜和涕滅威亞砜殘留的分析方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Xevo TQ-S型超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜儀(UPLC-MS/MS)(配有電噴霧離子源,美國Waters公司)；DS-1型高速組織搗碎機(上海標模儀器廠)；LD5-2A型低速離心機(北京京立離心機有限公司)；Oasis PRiME HLB通過式固相萃取柱(3 cc,150 mg,2 mL,部件號186008717,使用前無需活化,沃特世科技(上海)有限公司)；克百威(1 000 mg/L)和3-羥基克百威(1 000 mg/L)標準品購于北京振翔科技有限公司；涕滅威(100 mg/L)、涕滅威砜(100 mg/L)和涕滅威亞砜(100 mg/L)標準品均購于上海安普實驗科技股份有限公司；QuEChERS提取鹽包(含0.5 g檸檬酸二鈉鹽水合物、1 g 無水檸檬酸鈉、1 g氯化鈉、4 g MgSO4,部件號186006813,沃特世科技(上海)有限公司)；乙腈(色譜純,賽默飛世爾(中國)科技有限公司)。

1.2 標準溶液的配制

準確移取2種農藥及其代謝物標準溶液,用乙腈配成質量濃度為10 mg/L的標準中間混合溶液,使用時用溶劑或空白基質提取液逐級稀釋至所需濃度。

1.3 樣品前處理

取新鮮黃瓜、番茄和豇豆試樣(購于本地市場)，用組織搗碎機粉碎并混勻,準確稱取10.00 g,加入20.0 mL乙腈,渦旋提取1 min,再加入QuEChERS提取鹽包,渦旋提取1 min,以4 000 r/min離心5 min,收集上清液,供Oasis PRiME HLB固相萃取柱凈化。

將Oasis PRiME HLB固相萃取柱(無需活化)安裝到預先清潔過的錐形瓶上,取2 mL上清液通過Oasis PRiME HLB柱并收集全部濾液,過0.22 μm有機微孔濾膜,供UPLC-MS/MS測定。

1.4 超高效液相色譜-質譜條件

1.4.1 色譜條件色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm,美國Waters公司)；流動相：A為乙腈,B為0.1%甲酸溶液。梯度洗脫程序：0～0.8 min,10%～40% A；0.8～2.8 min,40%～60% A；2.8～3.8 min,60%～80% A；3.8～4.7 min,80%～90% A；4.7～5.7 min,90% A；5.7～6.0 min,90%～10% A；6.0～7.0 min,10% A；柱溫35 ℃,流速0.3 mL/min,進樣體積2.0 μL。

1.4.2 質譜條件采用電噴霧ESI+離子源,多反應監測(MRM)模式,脫溶劑氣溫度400 ℃,電噴霧電壓3.0 kV,離子源溫度150 ℃,脫溶劑氣流速700 L/h。在分析過程中,以離子對(母離子和兩個子離子)信息進行定性分析；以母離子和響應值最高的子離子進行定量分析。克百威、3-羥基克百威、涕滅威、涕滅威砜、涕滅威亞砜在多反應監測模式下的質譜參數見表1。

表1 克百威、3-羥基克百威、涕滅威、涕滅威砜和涕滅威亞砜的質譜參數Table 1 MS/MS parameters for the analysis of carbofuran,carbofuran-3-hydroxy,aldicarb,aldicarb-sulfone and aldicarb-sulfoxide

*quantitative ion

2 結果與討論

2.1 儀器條件的優化

2.1.1 質譜條件的優化采用0.5 mg/L待測化合物標準溶液,分別在正離子(ESI+)和負離子(ESI-)模式下進行全掃描。結果顯示,2種殺蟲劑及其代謝物均在ESI+模式下響應值更高,因此選擇正離子掃描方式,并確定了克百威、3-羥基克百威、涕滅威、涕滅威砜、涕滅威亞砜母離子分別為m/z222.1、238.0、213.1、223.0、207.0。其它優化后的質譜參數見表1。

2.1.2 色譜條件的優化實驗對比了甲醇和乙腈為有機流動相的分析效果,發現采用乙腈時各待測物峰形較好且響應值更高,因此選擇乙腈-0.1%甲酸溶液為流動相,并優化了流動相梯度洗脫條件,使待測農藥的靈敏度和重現性均較好。另外,實驗比較了BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)和HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)2種色譜柱的分離效果,結果發現采用BEH C18色譜柱分析時,待測農藥的峰形和保留時間均較理想。在優化色譜-質譜條件下,2種農藥及其代謝物在黃瓜、番茄和豇豆加標樣品中的MRM色譜圖如圖1所示,由圖可見,樣品基質不干擾2種農藥及其代謝物的測定。

圖1 2種殺蟲劑及其代謝物在黃瓜、番茄和豇豆混合空白樣品基質加標(0.05 mg/kg)下的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of 2 kinds of insecticides and its metabolites of mixed blank samples of cucumber,tomato and cowpea spiked at 0.05 mg/kg level

2.2 凈化方式的選擇

樣品的提取和凈化作為檢測方法的關鍵技術,直接影響方法的回收率、靈敏度和精密度,尤其是植物源性食品中存在的大量色素會隨著目標化合物被提取出來,基質干擾嚴重。本文采用乙腈渦旋提取1 min,加入QuEChERS提取鹽包,再渦旋提取1 min,離心后,上清液直接加載至Oasis PRiME HLB固相萃取柱以吸附色素等干擾物質,與傳統非通過式固相萃取凈化比較,本方法上樣前無需活化和平衡柱子,且不涉及洗脫和濃縮程序,顯著縮短了樣品前處理時間,操作更簡單,且方法回收率和精密度均滿足檢測要求。

2.3 樣品基質效應的考察

取不含待測物的黃瓜、番茄和豇豆空白樣品,經“1.3”方法處理后,到空白基質提取凈化液,用此基質提取凈化液逐級稀釋10 mg/L的待測物混合標準溶液,配成0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5 mg/L的基質提取凈化標準工作液。在優化的條件下進樣測定,以待測物質量濃度(X,mg/L)為橫坐標,對應定量離子對峰面積(Y)為縱坐標繪制基質匹配標準曲線。以基質匹配標準曲線斜率/純溶劑標準曲線斜率計算基質效應(ME),斜率比越接近1,表示基質效應越小,結果見表2。結果顯示,克百威和涕滅威及其代謝物3-羥基克百威、涕滅威砜、涕滅威亞砜均存在較大的基質效應(ME<0.8),這可能與樣品基質、化合物性質和離子化效果等因素相關。因此,為減小樣品基質效應,本實驗選擇基質匹配標準曲線外標法定量。

表2 黃瓜、番茄和豇豆中2種殺蟲劑及其代謝物的基質效應Table 2 Matrix effects of 2 kinds of insecticides and its metabolites residues in matrix of cucumber,tomato and cowpea

2.4 方法的線性范圍、檢出限與定量下限

在優化條件下,黃瓜、番茄和豇豆中的克百威、3-羥基克百威、涕滅威、涕滅威砜和涕滅威亞砜在0.001～0.5 mg/L范圍內具有良好的線性關系(見表2),相關系數均大于0.996 0。以3倍信噪比(S/N=3)計算得克百威、3-羥基克百威、涕滅威、涕滅威砜和涕滅威亞砜的檢出限(LOD)分別為0.07、0.3、1.0、4.0、13 μg/kg,以S/N=10計算得其定量下限(LOQ)分別為0.2、1.0、2.0、13、42 μg/kg。方法中各待測物的LOD均比國家限量標準值低[8],完全滿足日常檢測需求。

2.5 回收率與精密度

取市售未檢出2種農藥及其代謝物的黃瓜、番茄和豇豆樣品為空白進行低、中、高3個濃度水平的加標回收實驗(通過式凈化方式和非通過式凈化方式比較),10 g勻漿樣品中克百威、3-羥基克百威、涕滅威和涕滅威砜加標濃度為0.02、0.05、0.2 mg/kg,涕滅威亞砜為0.05、0.1、0.2 mg/kg,在優化條件下測定,結果見表3。結果顯示,克百威和涕滅威及其代謝物3-羥基克百威、涕滅威砜、涕滅威亞砜在黃瓜、番茄和豇豆中通過式和非通過式2種凈化方式的平均回收率分別為80.4%～110%和74.5%～99.6%,相對標準偏差(RSD)分別為1.1%～4.8%和1.4%～5.9%。由此可見,2種方法的回收率和精密度均滿足檢測要求,但本方法操作更簡單,樣品前處理時間更短,且回收率整體較高。

表3 實際樣品中2種殺蟲劑及其代謝物殘留量回收率和相對標準偏差(n=6)Table 3 Recoveries and RSD(n=6) of 2 kinds of insecticides and its metabolites resideces in real samples

2.6 實際樣品檢測

從本地農貿市場分別隨機抽取10份黃瓜、番茄和豇豆對其中的克百威、3-羥基克百威、涕滅威、涕滅威砜和涕滅威亞砜進行檢測,均未檢出上述農藥殘留。

3 結 論

本研究采用新型通過式固相萃取技術,建立了超高效液相色譜-串聯質譜法測定黃瓜、番茄和豇豆中克百威和涕滅威及其代謝物(3-羥基克百威、涕滅威砜、涕滅威亞砜)殘留的分析方法。采用通過式固相萃取技術,上樣前無需活化和平衡,以Oasis PRiME HLB替代常規填料GCB對樣品進行凈化,不但能去除色素、磷脂等干擾雜質且能保持待測物較高的回收率,同時有效的縮短了樣品前處理時間,方法操作簡便、靈敏度高、定量下限低、穩定可靠,滿足蔬菜中克百威和涕滅威及其代謝物殘留檢測與確證的需要。將其用于黃瓜、番茄和豇豆中克百威和涕滅威及其代謝物殘留的檢測分析,結果令人滿意。