現(xiàn)場(chǎng)制備表面增強(qiáng)拉曼光譜基底法快速檢測(cè)藥片中鹽酸阿米洛利的含量

黃天雄，王文明，陳萬(wàn)超，陸偲倩，杜一平

(上海功能性材料化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,華東理工大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院,上海 200237)

利尿劑是治療高血壓等疾病的常用藥，其機(jī)理是作用于腎臟以增加電解質(zhì)、水分排泄和增加尿量的藥物，根據(jù)其作用機(jī)制可分為三大類(lèi)，即環(huán)式利尿劑、噻嗪類(lèi)利尿劑和保鉀利尿劑[1]。鹽酸阿米洛利(N-脒基-3,5-二氨基-6-氯吡嗪-2-甲酰胺)屬于第三類(lèi)利尿劑，其作用于腎遠(yuǎn)曲小管，促使鈉、氯離子排泄而減少鉀、氫離子的分泌。復(fù)方鹽酸阿米洛利片主要由鹽酸阿米洛利和氫氯噻嗪復(fù)方制成，兼具保鉀利尿和抗高血壓的作用，常被用于治療高血壓病，以及心力衰竭和肝硬化等導(dǎo)致的水腫和腹水。但此藥物過(guò)量或者不當(dāng)使用會(huì)導(dǎo)致低鈉血癥、高血鉀癥，以及氮質(zhì)血癥和高尿酸血癥。因此，對(duì)于此藥物的生產(chǎn)、使用過(guò)程需嚴(yán)格的定量監(jiān)控。目前，鹽酸阿米洛利的定量分析方法主要有高效液相色譜法[2-3]和液相色譜-質(zhì)譜法[4-5]。但這些方法需要昂貴的儀器設(shè)備，且體積龐大不易攜帶，檢測(cè)耗時(shí)較長(zhǎng)，樣品前處理過(guò)程較復(fù)雜，不適用于大量樣本的快速檢測(cè)。使用漫反射光譜法[6]和電化學(xué)法[7]檢測(cè)鹽酸阿米洛利雖然樣品前處理簡(jiǎn)單，檢測(cè)快速，但其抗干擾能力相對(duì)較低。因此，建立一種適用于藥片中鹽酸阿米洛利的簡(jiǎn)便、快速、靈敏的定量檢測(cè)方法具有實(shí)際意義。

表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)由于具有水分干擾小、檢測(cè)快速、靈敏度高和能提供分子化學(xué)結(jié)構(gòu)信息等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于藥物分析[8-9]、食品安全[10-11]、環(huán)境檢測(cè)[12]等領(lǐng)域，而使用SERS對(duì)于鹽酸阿米洛利的檢測(cè)尚未發(fā)現(xiàn)報(bào)道。基底使用壽命短是目前SERS最主要的缺點(diǎn)之一，嚴(yán)重限制了其在實(shí)際樣品檢測(cè)中的應(yīng)用。本文通過(guò)對(duì)銀溶膠合成工藝進(jìn)行優(yōu)化，利用便捷的加熱貼快速制備銀溶膠，實(shí)現(xiàn)了現(xiàn)場(chǎng)合成基底用于SERS檢測(cè)，無(wú)需事先購(gòu)買(mǎi)基底，避免了基底壽命短的影響。將研發(fā)的基底用于藥片中鹽酸阿米洛利的定量檢測(cè)，并對(duì)分析性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。本工作為藥片中鹽酸阿米洛利含量的測(cè)定提供了一個(gè)快速、便捷的定量檢測(cè)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

i-Raman拉曼光譜儀(美國(guó)B&W Tek公司)，二極管激光器，激發(fā)波長(zhǎng)為785 nm，最大激發(fā)功率為300 mW，積分時(shí)間為10 s，配備顯微拉曼檢測(cè)平臺(tái)(20倍物鏡)；JEM-2100高分辨透射電子顯微鏡(日本電子株式會(huì)社)。

抗壞血酸(上海笛柏生物科技有限公司)，硝酸銀(上海泰坦科技股份有限公司)，檸檬酸三鈉(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)，鹽酸阿米洛利(阿拉丁試劑公司)，羅丹明6G(R6G，阿拉丁試劑公司)，氯化鈉(百靈威科技有限公司)，上述試劑均為分析純；復(fù)方鹽酸阿米洛利藥片(江蘇迪賽諾制藥有限公司)，加熱貼(大連華納科技有限公司)。所有試劑在使用過(guò)程中均未進(jìn)行再提純。實(shí)驗(yàn)用水均為超純水(18.2 MΩ·cm)，由德國(guó) Sartorius arium 611DI超純水儀制備得到。

1.2 銀溶膠的制備

在Qin等[13]的基礎(chǔ)上改進(jìn)了銀溶膠的制備方法：以抗壞血酸作為還原劑，檸檬酸三鈉為穩(wěn)定劑，通過(guò)還原硝酸銀制備銀溶膠基底。稱(chēng)取10.7 mg抗壞血酸和59.4 mg檸檬酸三鈉，用水溶解并定容至100 mL，取8 mL混合溶液于10 mL玻璃瓶(內(nèi)徑為18.4 mm，高度為65 mm)中。取一片加熱貼，待升溫至50 ℃，貼在玻璃瓶外壁，并向玻璃瓶中加入0.08 mL 0.1 mol/L的AgNO3溶液，反應(yīng)15 min后，撤去加熱貼，冷卻得到灰色的銀溶膠，避光存放待用。

1.3 樣品的制備

使用水溶解10 mg的鹽酸阿米洛利標(biāo)準(zhǔn)品，得到100 mg/L的鹽酸阿米洛利儲(chǔ)備液，于4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｒ迫?4個(gè)不同體積的鹽酸阿米洛利儲(chǔ)備液進(jìn)行稀釋?zhuān)玫劫|(zhì)量濃度分別為0.8、1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24、28 mg/L 的鹽酸阿米洛利標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4 ℃保存。

取一片復(fù)方鹽酸阿米洛利藥片(約0.1 g)研磨，準(zhǔn)確稱(chēng)取0.030 0 g的藥片粉末，加適量水超聲溶解后，用水定容至100 mL，溶液過(guò) 0.22 μm的聚醚砜膜，得到復(fù)方鹽酸阿米洛利藥片儲(chǔ)備液。采用加標(biāo)回收的方法評(píng)價(jià)檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度：取 2 mL藥片儲(chǔ)備液和0、1、2、3 mL 20 mg/L的鹽酸阿米洛利標(biāo)準(zhǔn)溶液分別混合后，用水稀釋至10 mL，得到藥片的待測(cè)樣本，每個(gè)加標(biāo)濃度配制3個(gè)樣本。

1.4 SERS光譜的檢測(cè)

取200 μL銀溶膠至2 mL離心管，加入200 μL樣品溶液和100 μL 1%的NaCl溶液，振蕩，取一定量于石英玻璃片上，利用便攜式拉曼光譜儀，通過(guò)將激光光斑聚焦于液滴表面來(lái)實(shí)現(xiàn)SERS信號(hào)的采集。樣本的采集參數(shù)如下：激光波長(zhǎng)785 nm，激光功率300 mW，物鏡倍數(shù)20倍，積分時(shí)間10 s，每個(gè)樣本采集5次。

2 結(jié)果與討論

2.1 銀溶膠的制備與表征

在銀溶膠的制備中，實(shí)驗(yàn)溫度控制著反應(yīng)的速度并最終影響合成銀納米顆粒的形狀和均一性[14-15]。本文在不同的水浴溫度下合成銀溶膠，以R6G為探針?lè)肿樱捎迷? 364 cm-1和1 511 cm-1處的特征峰強(qiáng)度[16]對(duì)合成的銀溶膠進(jìn)行SERS表征，以考察不同溫度合成的銀溶膠對(duì)SERS增強(qiáng)效果的影響。圖1A為不同水浴溫度下，所合成的銀溶膠測(cè)得R6G的SERS強(qiáng)度變化趨勢(shì)，圖中的強(qiáng)度和誤差棒均由3次平行SERS檢測(cè)計(jì)算而得?？梢钥闯鏊囟?0 ℃下所合成銀溶膠的SERS強(qiáng)度最高，當(dāng)溫度較低和較高時(shí)，SERS信號(hào)強(qiáng)度均有所降低。

圖1 不同溫度下合成的銀溶膠所測(cè)得R6G在1 364 cm-1和1 511 cm-1處的SERS信號(hào)(A)，以及使用3次加熱貼合成的銀溶膠與水浴50℃下制備的銀溶膠測(cè)得R6G的SERS信號(hào)(B)Fig.1 SERS intensities located at 1 364 cm-1 and 1 511 cm-1 of R6G determined by silver colloid synthesized at different temperatures(A), and SERS intensities of R6G determined by silver colloid synthesized by three pieces of heating pasters and at 50 ℃(B)

圖2 加熱貼合成的銀溶膠的透射電鏡圖Fig.2 TEM image of silver colloid synthesized by heating paster

為了更便捷地合成銀溶膠，本文采用加熱貼取代水浴鍋為銀溶膠的熱源。圖1B比較了水浴方式和加熱貼方式所制備基底的SERS檢測(cè)光譜強(qiáng)度，圖中a、b、c分別為使用3片同一批次加熱貼制備的銀溶膠檢測(cè)R6G的SERS強(qiáng)度，50 ℃表示采用水浴鍋在50 ℃下制備的基底的測(cè)定結(jié)果。圖1B顯示，使用3片同一批次(a、b、c)加熱貼制備的銀溶膠比較穩(wěn)定，SERS強(qiáng)度相差不大，1 364 cm-1峰強(qiáng)度批次間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.0%；1 511 cm-1峰強(qiáng)度批次間的RSD為2.3%。但其光譜強(qiáng)度明顯低于水浴加熱方式的光強(qiáng)。其原因可能是水浴能提供一個(gè)恒定的溫度狀態(tài)，而加熱貼則處于持續(xù)升溫或降溫過(guò)程，因此所制備的銀納米顆粒SERS增強(qiáng)效果不如水浴加熱制備的銀溶膠。此外，通過(guò)加熱貼制備的銀溶膠納米顆粒粒徑集中在80 nm左右(圖2)，產(chǎn)生SERS信號(hào)的熱點(diǎn)較少，導(dǎo)致SERS強(qiáng)度降低。但考慮到現(xiàn)場(chǎng)分析條件有限(如在野外、車(chē)間、市場(chǎng)、流通環(huán)節(jié)等)，加熱貼即拆即用，能夠快速、便捷地合成銀溶膠，因此，本文采用加熱貼為熱源。現(xiàn)場(chǎng)制備的銀溶膠在4 h內(nèi)可以保持穩(wěn)定，如果超過(guò)4 h則需重新制備銀溶膠。

圖3 鹽酸阿米洛利標(biāo)準(zhǔn)品固體粉末的拉曼光譜(A)，7.15 mg/L藥片儲(chǔ)備液(B)及8 mg/L鹽酸阿米洛利標(biāo)準(zhǔn)溶液(C)的SERS光譜Fig.3 Raman spectrum of amiloride hydrochloride solid powder(A)，SERS spectra of 7.15 mg/L tablet stock solution(B)and 8 mg/L amiloride hydrochloride standard(C)

2.2 鹽酸阿米洛利的SERS譜圖分析

使用加熱貼制備的銀溶膠測(cè)量了鹽酸阿米洛利標(biāo)準(zhǔn)品(固體粉末)的普通拉曼光譜，以及7.15 mg/L藥片儲(chǔ)備液和8 mg/L的鹽酸阿米洛利標(biāo)準(zhǔn)溶液的SERS光譜(圖3)。從圖中可見(jiàn)，三者的拉曼光譜峰一致性很好，主要譜峰可歸屬為742 cm-1(C—N—C伸縮振動(dòng))，1 384 cm-1(C—C伸縮振動(dòng))，1 516 cm-1(酰胺ⅡC—N伸縮振動(dòng))[17-18]。鑒于1 384 cm-1處的SERS信號(hào)強(qiáng)，受干擾小，因此選用其為分析峰進(jìn)行后續(xù)的定量分析。

2.3 鹽酸阿米洛利的定量檢測(cè)

使用現(xiàn)制備的銀溶膠對(duì)不同質(zhì)量濃度(0～28 mg/L)的鹽酸阿米洛利標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)，其SERS光譜圖如圖4A所示。由圖可知，檢測(cè)濃度低至0.8 mg/L時(shí)，仍可觀察觀察到較為明顯的特征峰。圖4B為峰強(qiáng)度與鹽酸阿米洛利質(zhì)量濃度的關(guān)系曲線，由插圖可知，在0.8～8 mg/L之間質(zhì)量濃度(ρ,mg/L)與1 384 cm-1處的拉曼峰強(qiáng)度(y)呈較好的線性關(guān)系，線性方程為：y=1 395ρ-76.40,r2=0.999 2。按空白溶液5次測(cè)定結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍，計(jì)算檢出限(LOD)為0.2 mg/L。

為進(jìn)一步評(píng)估本方法的可靠性，按照“1.3”進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。測(cè)得未加標(biāo)樣品濃度為1.43 mg/L，與藥品標(biāo)識(shí)濃度的折算濃度1.31 mg/L比較接近。3個(gè)加標(biāo)水平下的回收率為104%～106%，RSD為0.35%～3.5%，表明該方法具有較理想的檢測(cè)準(zhǔn)確度和精密度，適用于藥片中鹽酸阿米洛利的快速檢測(cè)。

圖4 不同質(zhì)量濃度鹽酸阿米洛利的SERS譜圖(A)，以及1 384 cm-1下SERS信號(hào)強(qiáng)度與質(zhì)量濃度的關(guān)系圖(B)Fig.4 SERS spectra of amiloride hydrochloride with different concentrations(A),and relationship between SERS intensity and concentration of amiloride hydrochloride at 1 384 cm-1(B) concentration of amiloride hydrochloride(a-i):28,20，10,8,4，2,1,0.8,0 mg/L

*no data

3 結(jié) 論

本文提出了快速、簡(jiǎn)便的銀溶膠制備方法，以適用于現(xiàn)場(chǎng)的快速SERS檢測(cè)，使用所研發(fā)的銀溶膠對(duì)藥片中鹽酸阿米洛利進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明，在0.8～8 mg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.999 2，LOD為0.2 mg/L，平均加標(biāo)回收率為104%～106%，RSD為0.35%～3.5%，方法具有較佳的可靠性和準(zhǔn)確性。同時(shí)，本文提出的基底制備和使用方法快速、簡(jiǎn)便、不受基底壽命的影響，可為藥物的SERS分析提供一條有效的途徑，有望在藥物分析中得到廣泛應(yīng)用。