分離式陰極光電化學檢測致病菌的新方法研究

楊高霞，董玉明，王光麗

(江南大學 化學與材料工程學院，江蘇 無錫 214122)

致病菌的檢測對于食品安全、環境保護和公共安全至關重要。在100多種已知的大腸桿菌中，大腸桿菌O157∶H7(E.coliO157∶H7)是一種可引起多種食源性疾病爆發的病原體，其感染劑量低至10個活細胞[1]。因此，E.coliO157∶H7的高靈敏度、快速檢測備受關注。傳統檢測E.coliO157∶H7的方法是培養法[2]，但這種方法耗時耗力，不能滿足快速檢測的要求。非培養方法，如核酸的聚合酶鏈反應(PCR)具有快速、高靈敏和特異性的優勢[3]，但該方法需要昂貴的設備和熟練的技術人員，從而限制了其廣泛應用。為了研制出更好方法，最近研究主要集中在電化學[4-7]、熒光[8]等方法的開發；但電化學分析法由于信號的激發及產生均采用同一種能量形式——電能，因而具有較高的背景信號[9]，且在檢測致病菌時，往往需要把生物分子固定在電極上[4-7]，導致靈敏度降低，限制了該方法的實際應用。新興的光電化學(PEC)分析因為具有裝置價廉、操作簡單并且易于微型化等優點而在多個領域得到了應用[10]，然而新型的PEC分析方法在致病菌檢測中的應用未受到關注。

PEC分析法是指基于物質的光電轉換特性而確定待測物濃度的一類分析方法，由于激發源(光)和檢測信號(電)是兩種完全不同的能量形式，因此該方法比傳統的電化學法具有更低的背景信號、更高的靈敏度，與光學檢測方法相比，PEC分析法所用的儀器更便宜且易于微型化[11]，因此在DNA分析、免疫測定、酶生物傳感等領域已被廣泛研究與應用[10]。在PEC分析中，相對于研究廣泛的以n型半導體構成的光電陽極為換能器的陽極PEC[12]，以p型半導體為光電極的陰極PEC不僅能使電極更加穩定而且對生物實際樣品中共存的還原性物質的抗干擾能力更強[13]，在生物分析中具有誘人的應用前景。基于此，本文提出了一種通過形成量子阱(QW)結構以增強陰極光電流的新策略，并將其成功應用于致病菌E.coliO157∶H7的分離式陰極PEC檢測。這種分離式陰極PEC檢測將生物反應放至微孔板中進行，所產生的信號物質Zn2+與PbSe QDs表面的Pb2+發生離子交換反應后，形成ZnSe/PbSe/ZnSe QW結構，使ITO/PbSe電極的陰極光電流得到極大提高。由于生物分子未固定在電極表面，因此避免了常規PEC分析中，電極表面固定的生物分子由于空間位阻效應阻礙信號分子(通常是溶液中的電子受體/供體)擴散至電極表面產生信號。該方法成功開拓了陰極光電化學在致病菌檢測中的應用，有望為開發其它新型高效的PEC檢測方法提供參考。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

硝酸鉛、硒粉(Se)、硼氫化鈉、巰基乙酸(TGA)、氫氧化鈉、硝酸鋅(Zn(NO3)2)、硫化鈉、甲醇、N-(3-(二甲基氨基)丙基)-N′-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)均購自國藥集團化學試劑有限公司；磷酸鹽緩沖溶液(PBS，由4.4 mmol/L Na2HPO4、1.4 mmol/L KH2PO4、2.7 mmol/L KCl和137 mmol/L NaCl組成，pH 7.4，25 ℃)；牛血清白蛋白(BSA)；聚二烯丙基二甲基氯化銨(PDDA，質量分數為20%的水溶液，平均分子量為200 000～350 000)購自美國 Sigma-Aldrich 公司；(3-巰基丙基)三乙氧基硅烷(MTPES)、4-馬來酰亞胺丁酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(GMBS)購自上海麥克林生化科技有限公司；大腸桿菌O157∶H7(E.coliO157∶H7，ATCC 35150)購自美國菌種保藏中心(ATCC)。大腸桿菌DH5α(E.coliDH5α)、沙門氏菌(Salmonella)、銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)、李斯特菌(Listeria)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)和金黃色葡萄球菌(S.aureus)獲自江南大學生物工程學院。抗菌肽Magainin I的序列是GIGKFLHSAGKFGKAFVGEIMKS(23 mer)；Magainin I-C是在Magainin I的C末端用半胱氨酸修飾的抗菌肽，其序列是GIGKFLHSAGKFGKAFVGEIMKSC(24 mer)，上述兩種抗菌肽由南京肽業生物科技有限公司合成并純化。

用實驗室自組裝的PEC檢測系統進行光電化學(PEC)測量，激發光為500 W 的氙燈(配備紫外線截止濾光片，λ≥400 nm)，CHI 800C電化學工作站(上海辰華儀器有限公司)獲得光電流。檢測光電流的三電極系統：PbSe QDs修飾的ITO玻璃電極(深圳南玻顯示器件有限公司)為工作電極，飽和Ag/AgCl電極為參比電極，Pt電極作為對電極；所有PEC測試均在0.1 mol/L Tris-HCl(pH 7.0)中進行，電極上的施加電位為-0.05 V(相對于飽和Ag/AgCl)。

1.2 水溶性PbSe QDs的合成及ITO/PbSe電極的制備

巰基乙酸(TGA)修飾的PbSe QDs的制備參照文獻[14]稍作修改：在N2氣氛下利用超聲將3.0 mg Se粉和7.6 mg NaBH4溶解于2.0 mL超純水中以制備新鮮的NaHSe。將25 mL 4.0 mmol/L Pb(NO3)2水溶液與12 μL TGA在圓底三頸燒瓶中混合后，通過1.0 mol/L NaOH溶液將混合液調至約pH 9.0。N2鼓泡0.5 h以除去反應溶液中溶解的O2后，緩慢注入2.0 mL新制備的NaHSe溶液，反應溶液的顏色由無色逐漸變為深棕色。在N2氣氛下將反應混合物再攪拌4 h后，將所制備的PbSe QDs在4 ℃下避光保存。

基于帶正電的PDDA和帶負電的TGA修飾的PbSe QDs間的靜電作用，使用自組裝方法在ITO玻璃上修飾PbSe QDs。ITO通過在2.0 mol/L KOH溶液(溶解在異丙醇中)中煮沸20 min后，用水徹底洗滌并在120 ℃下干燥2 h來清潔。將潔凈的ITO玻璃依次浸入含有0.5 mol/L NaCl和2%PDDA的水溶液、PbSe QDs溶液中各10 min來制備ITO/PbSe電極，每個浸泡步驟后用超純水洗滌電極。

1.3 細菌培養與計數

大腸桿菌O157∶H7(E.coliO157∶H7)以及其他致病菌株如大腸桿菌DH5α(E.coliDH5α)、沙門氏菌(Salmonella)、銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)和金黃色葡萄球菌(S.aureus)的培養均使用Luria -Bertani(LB)培養基，即含10 g/L胰蛋白胨、10 g/L NaCl、5 g/L酵母提取物的混合物；李斯特菌(Listeria)的培養基為10 g/L胰蛋白胨、3 g/L牛肉提取物和5 g/L NaCl的混合物。所有菌株均在37 ℃下的營養培養基中振蕩(125 r/min)孵育,培養完畢，通過離心(6 000 r/min，20 min)分離所有細菌細胞后，用0.01 mol/L過濾后的pH 7.4 PBS緩沖液(由4.4 mmol/L Na2HPO4、1.4 mmol/L KH2PO4、2.7 mmol/L KCl和137 mmol / L NaCl組成, 25 ℃)離心洗滌3次，并重新懸浮于0.01 mol/L過濾后的PBS中以除去殘留的培養基。

使用平板計數法測定細菌細胞懸浮液的濃度，隨后將等分試樣的細菌細胞懸浮液用過濾后的PBS稀釋至所需濃度，再將細菌細胞懸浮液在沸水浴中加熱滅活15 min，最后儲存在冰箱中備用。

1.4 實體樣的檢測

從當地郊區獲取的生菜和菠菜(確定施過糞肥)作為待測樣品；按照文獻處理樣品[15]：稱取25 g樣品，研磨30 min后，加入225 mL 0.01 mol/L滅菌的PBS緩沖液攪拌10 min，混合均勻后，過濾混合物，收集濾液。取適量的該濾液直接用本文開發的分離式PEC法進行檢測，以國家標準方法即平板計數法[16]作為參照。

1.5 TGA-ZnS QDs的合成及TGA-ZnS QDs/Magainin I-C生物復合物的制備

為了實現檢測，以制備TGA修飾的ZnS QDs(TGA-ZnS QDs)和Magainin I-C的生物復合物(即TGA-ZnS QDs/Magainin I-C)作為信號標記物。首先，按照文獻[17]稍作修改后合成水溶性TGA-ZnS QDs，即將50 mL 0.02 mol/L Zn(NO3)2水溶液與250 μL TGA在圓底三頸燒瓶中混合。通過加入1 mol/L NaOH將溶液的pH值調至7.5，使混合液變澄清透明；將該溶液通入氮氣0.5 h后加入2 mL 0.25 mol/L Na2S，并將溶液在100 ℃下加熱4 h，反應結束后用異丙醇沉淀，離心，用水溶解洗滌，如此反復3次以除去未反應的試劑，烘干。稱取40 mg TGA-ZnS QDs溶解于1 mL水中(40 mg/mL)，利用EDC和NHS(ZnS∶EDC∶NHS = 1∶1.5∶1.5的摩爾比)在室溫下與TGA-ZnS QDs混合4 h以活化表面羧基，然后離心洗滌除掉過量的EDC和NHS。將88.2 μg Magainin I-C加至活化后的TGA-ZnS QDs溶液中，室溫下攪拌12 h，離心洗滌。最后，將TGA-ZnS QDs/Magainin I-C生物復合物再分散于6 mL 10 mmol/L PBS緩沖溶液(pH 7.4)中以供使用。

1.6 分離式PEC檢測E.coli O157∶H7

在硅烷化96微孔板之前先用甲醇沖洗96微孔板，然后通過GMBS將Magainin I固定在96微孔板上[18]。具體步驟為：用100 μL的2%硅烷(MPTES)溶液覆蓋微孔(將MPTES溶解在用1.0 mol/L乙酸調至pH 4.0的甲醇中)并溫育30 min，隨后去除溶液并用甲醇洗滌，氮氣干燥；然后取100 μL 1.0 mmol/L GMBS的無水乙醇溶液加入微孔板，孵育30 min后去掉溶液并洗滌；隨后向孔中加入100 μL 250 μg/mL Magainin I溶液(以10 mmol/L的PBS緩沖溶液作為溶劑)，在室溫下振蕩孵育2 h；然后加入100 μL的1%BSA封閉液封閉30 min，洗滌；再加入100 μL不同濃度的E.coliO157∶H7并在室溫下孵育30 min，洗滌；隨后加入TGA-ZnS QDs/Magainin I-C生物復合物，孵育30 min，洗滌。加入60 μL 0.1 mol/L HNO3溶解TGA-ZnS QDs后，再加入60 μL 0.1 mol/L NaOH將溶液調至pH 7.0。最后，將ITO/PbSe電極浸入含有上述溶液的96微孔板中15 min。取出電極，用0.1 mol/L Tris-HCl(pH 7.0)洗滌，并在0.1 mol/L Tris-HCl(pH 7.0)中進行PEC測量。

2 結果與討論

2.1 PbSe QDs的表征

采用X射線衍射法(XRD)以及透射電鏡法(TEM)對合成的PbSe QDs的組成和形貌進行表征。PbSe QDs的XRD圖譜在25.15°、29.12°、41.65°、49.28°、51.63°、60.37°、68.41°、76.02°處出現尖銳的衍射峰(圖1A)，對應晶面分別為(111)、(200)、(220)、(311)、(222)、(400)、(420)和(422)，與巖鹽晶體結構的PbSe(JCPDS 06-0354)一致。TEM圖表明所合成的PbSe QDs為球形粒子，直徑約為3.0 nm(圖1B)。

2.2 Zn2+增大ITO/PbSe電極陰極光電流的機理

ITO/PbSe電極在可見光照射下顯示出陰極光電流，在重復光激發循環照射下，光電流無明顯降低，表明該電極具有良好的光照穩定性(圖1C)。PbSe QDs的光電流產生機理如下：當能量等于或大于其帶隙能量的光子激發PbSe QDs時，分別在導帶(CB)和價帶(VB)上形成電子和空穴。光生電子從PbSe的CB轉移至溶液中的電子受體，光生空穴被ITO電極上的電子捕獲，產生陰極光電流。在Zn2+存在下，ITO/PbSe電極的光電流顯著增強(圖1D)。這是由于Zn2+的離子半徑小于Pb2+，即ZnSe的晶格能高于PbSe的晶格能，因此Zn2+能和PbSe中的Pb2+發生陽離子交換反應形成ZnSe[19]。采用X射線光電子能譜(XPS)對通過Zn2+處理前后的ITO/PbSe電極進行全掃描(圖2A)，通過Zn2+處理ITO/PbSe電極后可觀察到明顯的Zn 2p峰，表明PbSe QDs表面形成了ZnSe。分別對Pb 4f，Zn 2p和Se 3d進行高分辨率XPS光譜分析(圖2B-D)，其中B圖在137.3 eV和142.4 eV處的結合能分別為Pb 4f7/2和Pb 4f5/2的自旋軌道，C圖在1 025.14 eV的結合能歸屬于Zn 2p3/2自旋軌道，而D圖的52.98 eV和53.8 eV的結合能則分別為Se 3d5/2和Se 3d3/2自旋軌道。根據價帶和導帶的帶隙位置，表明PbSe QDs表面沉積ZnSe后，形成了ZnSe/PbSe/ZnSe量子阱(QW)結構，由于這種結構界面處(即PbSe/ZnSe界面)的晶格錯配產生壓電極化電荷，這些極化電荷導致在PbSe層形成三角形勢阱。正/負壓電電荷在左/右側累積，從而在QW中引起能帶的線性傾斜，然后電子和空穴的波函數在傾斜帶中以相反的方向分離，將波函數重疊減小到較低的輻射復合率[20-21]，從而產生更多的光生載流子，使陰極光電流得到極大提高。

圖1 PbSe QDs的XRD(A)及TEM圖(B)，ITO/PbSe電極的光穩定性測試(灰色區域為光照條件下，C)，及0.1 mmol/L Zn2+存在下ITO/PbSe電極的光電流響應(D)Fig.1 XRD(A)and SEM(B)images of PbSe QDs,the operational stability test of ITO/PbSe electrode(the grey area are on illumination,C),and photocurrent response of ITO/PbSe QDs electrode in the presence of 0.1 mmol/L Zn2+(D)

2.3 分離式檢測原理

根據Zn2+可以增強ITO/PbSe電極的陰極光電流這一現象，本文設計了分離式陰極PEC檢測E.coliO157∶H7的方法。其檢測原理如圖3所示：選擇抗菌肽Magainin I和Magainin I-C來識別E.coliO157∶H7[22]。這是由于相比較于抗體，抗菌肽具有在惡劣環境條件下依然保持活性，不會使細菌產生抗性，以及低濃度下也能起識別作用等優點[23]。首先，通過GMBS將Magainin I固定在微孔板上以識別E.coliO157∶H7，再引入TGA-ZnS QDs/Magainin I-C生物復合物(選TGA-ZnS QDs作為示蹤劑是因為其易于合成且可被HNO3溶解產生Zn2+)使其結合E.coliO157∶H7。通過TGA-ZnS QDs產生Zn2+與ITO/PbSe電極表面上的Pb2+交換，增強陰極光電流。通過UV-Vis吸收光譜法可觀察到TGA-ZnS和Magainin I-C的特征吸收峰，證實了TGA-ZnS QDs/Magainin I-C生物復合物的成功合成(圖4)。

圖2 ITO/PbSe電極及其用0.1 mmol/L Zn2+處理后的全掃描XPS光譜(A)；Pb 4f(B)，Zn 2p(C)及Se 3d(D)的高分辨率XPS光譜Fig.2 Full-scan XPS spectra of ITO/PbSe QDs before and after reacting with 0.1 mmol/L Zn2+(A),high-resolution XPS spectra of Pb 4f(B),Zn 2p(C)and Se 3d(D)

圖3 E.coli O157∶H7的分離式PEC生物測定示意圖(A)，Zn2+與PbSe QDs中Pb2+的交換示意圖(B)，及與Zn2+反應后ITO/PbSe電極信號的產生機理(C)Fig.3 Schematic diagram of the split-type PEC bioassay for E.coli O157∶H7(A),diagrammatic sketch of Zn2+exchange with Pb2+of PbSe QDs(B),and the signal generation mechanism of ITO/PbSe electrode after treated with Zn2+(C)

2.4 實驗條件的優化

為了實現對E.coliO157∶H7的最佳檢測，本文優化了生物反應的實驗參數，通過研究發現E.coliO157∶H7和Magainin I的孵育溶液pH值和孵育時間對檢測結果影響較大。首先對孵育溶液的pH從偏酸性開始考察，隨著pH值的提高，體系的光電流增強，當pH值7.4時體系的光電流強度最大，隨著pH值的繼續增大，光電流反而減弱,因此本實驗選擇孵育溶液的最佳pH值為7.4(圖5)。此外，隨著孵育時間的增加，檢測體系的光電流也在增強，當孵育30 min后，檢測體系的光電流不再隨時間的延長而增強，表明體系已達到飽和狀態，因此實驗選擇30 min為最佳孵育時間。

圖5 pH值的影響Fig.5 Effect of pH value

圖4 TGA-ZnS QDs(a)、Magainin I-C(b)及TGA-ZnS QDs/Magainin I-C生物復合物(c)的UV-Vis吸收光譜Fig.4 UV-Vis absorption spectra of TGA-ZnS QDs(a),Magainin I-C(b) and TGA-ZnS QDs/Magainin I-C bioconjugates(c)

2.5 E.coli O157∶H7的PEC分析及與其他檢測方法的比較

在最優實驗條件下，體系的光電流強度(ΔI)隨著E.coliO157∶H7濃度(C,CFU/mL)的升高而升高，在10.0～5.0×106CFU/mL范圍內呈線性增強，線性方程為ΔI=0.37logC-0.38，檢出限(LOD，S/N=3)為4.0 CFU/mL。表1對本方法及其它檢測E.coliO157∶H7的方法進行比較，如電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)[24]、免疫色譜法(ICA)[25]、電化學發光法(ECL)[26]及電化學法(EC)[5-7,27]。可以看出，本文所開發的分離式PEC檢測法在靈敏度和線性范圍方面具有明顯優勢。

圖6 E.coli O157∶H7(5.0×105 CFU/mL)與其它干擾物(1.0×106 CFU/mL)的響應Fig.6 Response for E.coli O157∶H7(5.0×105 CFU/mL)and other interferents(1.0×106 CFU/mL)

2.6 干擾菌的影響

除檢測目標致病菌E.coliO157∶H7外，PEC傳感器還用于檢測非致病性大腸桿菌DH5α(E.coliDH5α)、沙門氏菌(Salmonella)以及銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)、李斯特菌(Listeria)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)和金黃色葡萄球菌(S.aureus)4種革蘭氏陽性菌以評估該方法的選擇性(圖6)。結果顯示，除沙門氏菌外，其他幾種物質均未產生明顯的光電流變化。這是由于Magainin I與Magainin I-C僅特異性結合帶有O-抗原側鏈脂多糖(LPS)的細胞膜[28-29]。本文的工作可用于區分致病性大腸桿菌和非致病性大腸桿菌以及革蘭氏陰性與陽性菌，意味著基于抗菌肽的傳感器具有檢測革蘭氏陰性細菌的潛力。但本傳感器不能區分革蘭氏陰性致病菌大腸桿菌與沙門氏菌，其主要原因是兩者細胞膜具有相似的結構，這與文獻結果一致[30]；由于E.coliO157∶H7一般污染施過糞肥的農產品[31]，而肉類產品一般在運輸或牲畜屠宰過程中受沙門氏菌污染[32]。因此，本文開發的傳感器雖不能區分這兩種菌，但可以應用于實際樣品的檢測。

表1 不同檢測E.coli O157∶H7方法的比較Table 1 Comparison with different methods for detection of E.coli O157∶H7

(續表1)

MethodMaterialLinearrange(CFU/mL)LOD(CFU/mL)ReferenceECLRucomplex5.0×102～5.0×1051.3×102[26]ECPPy/AuNP/MWCNT30.0～3.0×10730.0[5]ECrGO-NR-Au@Pt4.0×102～4.0×1084.5×102[6]ECFc1.0×103～1.0×1081.0×103[7]ECrGOPE1.5×102～1.5×1071.5×102[27]PECPbSeQDs10.0～5.0×1064.0Thiswork

*：no data

2.7 實體樣的檢測

為了評估該PEC傳感器用于實際樣品檢測的可行性，分別檢測了生菜和菠菜濾液中E.coliO157∶H7的含量，結果見表2。檢測結果與檢測微生物的標準法(平板計數法)檢測結果進行比較，計算出t值小于t0.1,4(2.13)，表明本方法與標準方法具有良好的一致性。

通過標準加入法在自來水和胡蘿卜汁(購自超市)中分別添加1.00×102、1.00×104和1.00×106CFU/mL 3種濃度(平板計數法讀出)的滅活E.coliO157∶H7，以計算本方法的加標回收率。結果顯示，本方法未在自來水或胡蘿卜汁中檢出E.coliO157∶H7，說明本實驗所用的自來水和胡蘿卜汁中的E.coliO157∶H7含量未在檢測范圍內，均符合衛生標準。測得本方法的回收率為94.7%～104%，相對標準偏差(RSD)為1.9%～2.8%。表明本文建立的抗菌肽的分離式PEC策略在實際應用中具有較好的效果(表3)。

表2 生菜和菠菜中E.coli O157∶H7含量的檢測Table 2 Detection of E.coli O157∶H7 content in lettuce and spinach (n=5)

*was figured by means of at-test statistical analysis between two methods

表3 自來水和胡蘿卜汁中E.coli O157∶H7的加標回收率Table 3 Spiked recoveries of E.coli O157∶H7 in tap water and carrot juice (n=5)

* no detected

3 結 論

本研究發現通過在PbSe QDs表面形成ZnSe并構成ZnSe/PbSe/ZnSe 量子阱(QW)結構，能明顯提高PbSe的陰極光電流。這是量子阱結構在PEC研究中的新應用。基于此，開發了一種分離式陰極PEC檢測E.coliO157∶H7的新方法，E.coliO157∶H7的檢測范圍為10.0～5.0×106CFU/mL，檢出限為4.0 CFU/mL。與標準方法相比，本PEC分析法無需進一步孵育、方便快速，有望為食品安全、環境衛生等領域監測E.coliO157∶H7提供一種快速高效的途徑。