N端無半胱氨酸斷裂蛋白質內含子的構建

李 佳, 孟 清

(東華大學 生物科學與技術研究所，上海 201620)

蛋白質修飾指通過各種化學方法和生物方法對目標蛋白在各種環境中進行操作，以便更好地研究蛋白的結構、生物學功能及蛋白與蛋白之間的相互作用[1-3]。化學手段存在許多不足之處：常用的化學基團會產生混合的標記蛋白；有些對蛋白的濃度和蛋白的側鏈性質要求較高，普遍性不強[4]；多肽配體、熒光配體、其它小分子配體的非共價標記不穩定，而且多肽蛋白的存在可能會干擾蛋白的功能[5-9]；通過蛋白質翻譯過程引入一個非自然的氨基酸到目標蛋白上，也可以實現無縫標記，可是這個技術比較復雜，對引入的標簽或修飾類型也有較多的限制[10]。

蛋白質內含子(intein)是具有自我催化活性的蛋白質。翻譯成熟后，內含子會自我切除，然后將兩側的外顯子(extein)以肽鍵的形式連接起來[11]。而斷裂蛋白質內含子(split intein)的N端和C端可以相互識別，形成有活性的蛋白構象，然后發生反式剪接反應(trans-splicing)[12]。在某些情況下，split intein的某一端可以發生斷裂反應(cleavage)：當N端外顯子缺失時，會催化inetin的C端發生斷裂，在蛋白的N末端產生一個硫酯鍵，然后可以利用化學反應添加一個標記物到蛋白質的N末端[13]；當C端外顯子缺失時，N末端的斷裂反應會在N端外顯子的C末端產生一個硫酯鍵[14-15]，接下來這個硫酯鍵可以和半胱氨酸殘基或者標記的半胱氨酸殘基類似物反應，實現對蛋白的特異性標記[16-18]。

利用斷裂蛋白內含子的反式剪接特性對目標蛋白進行標記是一個非常有潛力的生物標記工具，其主要優點有[19-21]：引入較少或者通過突變不引入外源氨基酸；對目標蛋白結構和功能影響較??；功能比較保守，即較小的N端或C端片段依然能夠和對應的大片段反應；不用合成多肽，成本較低；應用范圍廣泛。然而目前仍有許多因素限制該技術的廣泛應用：剪接效率不穩定，蛋白質內含子兩側外顯子不同就會呈現不同的剪接效率；融合蛋白溶解性不好，經常會產生包涵體等，可能會影響后續蛋白的正確折疊；活性和通用性差，不同的蛋白質內含子在異源宿主中的活性不均一，且只在某些特定條件下才能有較好的剪接活性。因此，發現和構建更多有活性的斷裂蛋白質內含子是擴大斷裂蛋白質標記應用范圍有效可行的方法。

本文在Inbase數據庫和實驗室獲得了幾個1位不是Cys的蛋白質內含子作為研究對象，通過定點突變、體內體外斷裂、蛋白親和層析、Western Blot等技術獲得了2個體內斷裂蛋白質內含子pMHP-S1和pMMD-S11，1個體外斷裂蛋白質內含子pMTX-S1(C1/S)。它們都具有較高的剪接活性，可以用于后續蛋白質N端標記和相關應用。

1 材料和方法

1.1 蛋白質內含子的選擇和基因序列的獲得

根據課題的需要和選擇條件，最后選擇的蛋白質內含子為TerNdse-2、TerThyX(已經改造成TX-S1)、HaV01 Po1、MsmDnaB-1和Arsp-FB24。其中TX-S1和TerNdse-2為本實驗室所有，HaV01 Po1由日本東京大學Shmuel Pietrokovski教授贈送[22]，其它蛋白質內含子通過比對后，去除多余外顯子、歸巢核酸酶內切酶區域及優化密碼子后由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2 微小蛋白質內含子的構建及剪接活性的檢測

通過全基因合成獲得MsmDnaB-1和ArspFB24 2個蛋白質內含子的cDNA序列。然后將cDNA序列克隆到pMalI載體內。利用IPTG誘導E.coliBL21表達目的蛋白，然后通過Western Blot檢測這些intein的剪接活性。

1.3 N端無半胱氨酸蛋白質內含子的構建及剪接活性的檢測

通過檢測發現只有TerNdse-2、pMTX-S1和pMHP具有剪接活性。接下來將通過反向PCR或者搭橋PCR的方法對蛋白質內含子內部半胱氨酸進行定點突變。

1.3.1TerNdse-2

TerNdse-2內部兩個半胱氨酸相近48個堿基，設計一對反向PCR引物P1和P2(見表1)，以pMTerNdse-2為模板進行擴增。

1.3.2 pMTX-S1(C1/S)-CF的構建及剪接活性的檢測

pMTX-S1斷裂蛋白質內含子有剪接活性，將N端外顯子突變為GGS后仍有較高的剪接活性，因此通過反向PCR引物P3和P4將1位的半胱氨酸C突變成絲氨酸S(見表1)。

表1 引物序列

1.3.3MsmDnaB-1和ArspFB24

MsmDnaB-1和ArspFB24的1位都不是半胱氨酸，在全基因合成時，會同時將外顯子或非必需的內部半胱氨酸合成為絲氨酸。

1.4 N端無半胱氨酸斷裂蛋白質內含子的構建及剪接活性的檢測

將pMMD、pMTX和pMHP與微小蛋白質內含子SspDnaB的氨基酸序列進行比對，按照比對結果(圖3)確定S1、S0和S11的斷裂位置，設計對應的PCR引物進行反向PCR或搭橋PCR，構建對應的體內斷裂內含子。

1.5 體外斷裂蛋白質內含子的構建和剪接活性的檢測

1.5.1 構建斷裂蛋白質內含子N端表達質粒

采用AflII和Hind III雙酶切法將斷裂蛋白質內含子TX-S1和MD-S11的C端DNA序列以及后面硫氧還蛋白對應的DNA序列切除，形成的N端表達質粒只含有麥芽糖結合蛋白和斷裂蛋白質內含子的N端部分。

1.5.2 構建斷裂蛋白質內含子C端表達質粒

采用NdeI和PstI雙酶切法將斷裂蛋白質內含子TX-S1和MD-S11的C端以及硫氧還蛋白對應的DNA序列從載體上切下來，然后將片段連入pTWIN表達載體中，得到pTTX-S1C和pTMD-S11C兩個前體蛋白表達質粒。

1.6 體外斷裂蛋白質內含子的純化

N端前體蛋白質內含子的純化：將質粒pMTX-S1N、pMMD-S11N和pMMD-F4N轉化到感受態細胞E.coliDH5α內。通過超聲破碎釋放蛋白到溶液中，然后通過親和層析純化N端融合蛋白。C端前體蛋白質內含子的純化：將質粒pTTX-S1C和pTMD-S11C電擊轉化到E.coliBL21(DE3)中。通過Ni-NTA純化C端融合蛋白。所有操作均在冰上，離心溫度為4 ℃。最后利用SDS-PAGE凝膠系統檢測N端和C端蛋白質的表達和純化情況。

1.7 斷裂蛋白質內含子體外剪接

在體外條件下檢測斷裂蛋白之間的剪接反應情況。體外剪接條件一般為：N端前體蛋白和C端前體蛋白的摩爾比為1∶ 1，DTT的終濃度為1 mmol/L，25 ℃，反應12～24 h。取20 μL反應后的混合樣品做Western Blot檢測。

2 結果與分析

2.1 蛋白質內含子的選擇

在Inbase數據庫，我們選擇N端第1位不是Cys，且內部Cys數量較少的intein，篩選結果如表2。

表2 蛋白質內含子基本信息

其中TerNdse-2、TerThyX和HaV01 Pol是I型蛋白質內含子，具有標準的剪接機制。而MsmDnaB-1和ArspFB24為III型蛋白質內含子，它們內部僅有2個半胱氨酸，其中一個是剪接發生所必需的，根據文獻報道這些intein也可以在E.coli中表達和剪接[23-25]。

2.2 微小蛋白質內含子的構建及剪接活性的檢測

TerNdse2為本實驗室所有，已經做過適當的改造，尤其pMTX-S1(C1/S，由TerThyX改造后獲得)有較好的剪接活性。蛋白質內含子Arsp-FB24和MsmDnaB-1兩側的外顯子不能太多，一般不超過3個氨基酸，同時將Cys替換成Ser。但是F模塊的Cys是III型蛋白質內含子剪接所必需的氨基酸之一，因此不能被其他氨基酸替代，如圖1所示。Arsp-FB24和MsmDnaB-1全基因合成前，同樣對其密碼子進行了優化。

MsmDnaB-1、Arsp-FB24為全基因合成，TerNdse2和pMTX-S1為本實驗室所有，內含子序列均插入到pMall載體內。構建好的的質粒分別命名為pMMD、pMAF、pMNdse和pMTX-S1(C1/S)。

圖1 蛋白質內含子改造后的氨基酸序列

注：紅色表示Cys和由Cys突變成的Ser

蛋白質內含子發生剪接后，會將兩側的外顯子麥芽糖結合蛋白M和硫氧還蛋白T以肽鍵的形式連接起來，形成約56 ku的剪接條帶MT。然后通過抗硫氧還蛋白抗體檢測到含有T的蛋白條帶，如圖2。

從圖2中可以看出,只有pMHP、pMMD和pMTX有較高的體內剪接活性，而pMNdse-2、pMMD-C1F和pMAF沒有檢測到任何的剪接活性，基本上都是以前體的形式存在。但是本實驗室之前的研究發現pMNdse-2在通常的剪接條件下是有剪接活性的，可能由于實驗條件和操作或者蛋白質內含子本身剪接條件的敏感性等原因而沒有活性。

1：pMRBS1G表達剪接的M+T蛋白(55.4 ku)；2：pMNdse-2剪接情況；3：pMHP剪接情況；4：pMMD-C1F剪接情況(將內部唯一的半胱氨酸替換成絲氨酸)；5：pMAF的剪接情況；6：pMMD的剪接活性；7：pMTX剪接情況。MT：剪接條帶；MIT：未發生剪接的前體蛋白；MIT*：未剪接的分枝狀前體蛋白

圖2原始蛋白質內含子的剪接活性

Figure 2 Splicing activity of different original inteins in vivo, respectively

-：代表空缺，主要是為了優化比對結果；*：表示相同的氨基酸；點號：表示相似的氨基酸；冒號：表示保守的氨基酸；箭頭：HaVolPo1、TerThyX和MsmDnaB-1序列中，S1、S0和S11斷裂位點；下劃線：SspDnaB中的12個β折疊(β 1-12)。其中TerThyX為1N端外顯子和1位氨基酸突變后的序列進行比對的

圖3HaVolPo1、TerThyX、MsmDnaB和SspDnaB序列比對

Figure 3 Alignment of amino acid sequence ofHaVolPo1,TerThyX,MsmDnaB-1 andSspDnaB

2.3 N端無半胱氨酸體內斷裂蛋白質內含子的構建及剪接活性的檢測

通過圖4看到原始斷裂位點S1、S0和S11中只有pMMD-S11和pMTX-S1有剪接活性。接下來我們構建了pMHP(G/T)S1、pMMD-S11和pMTX-S1的體外斷裂蛋白質內含子。

2.4 體外斷裂蛋白質內含子的構建和剪接活性的檢測

2.4.1 前體蛋白質的純化

將含有蛋白質內含子N端和C端的質粒轉入對應的表達菌株內，通過IPTG誘導前體蛋白表達。從圖5中可以看到N端前體蛋白和C端前體蛋白純化效果都比較好，pTTX-S1C純化的比較少是因為Ni-NTA resin結合特異性不高造成的，但蛋白的濃度已經達到體外剪接所需要的濃度。pMHP-S1N純化效果也很好(結果未顯示)，但是卻純化不到其C端前體蛋白pTHP-S1C，后續可能會優化表達條件或者換取其他高表達載體嘗試一下。

RBS1G：MT陽性對照；MT：剪接產物MT；MIT：未發生剪接的前體蛋白質；MIT*：未發生剪接的分支狀中間體；IT：發生N端斷裂的產物；T：發生C端斷裂的產物

圖4pMHP、pMHPG、pMMD、pMHPT和pMTX-S1在
位點S1、S0和S11剪接活性的檢測

Figure 4Tans-splicing activity of pMHP, pMHPG, pMMD, pMHPT and pMTXS1 at S1, S0 and S11 sites， respectively

2.4.2 斷裂蛋白質內含子的體外剪接反應

將目標intein的前體蛋白按照體外剪接反應條件混合均勻，置于25 ℃常溫下反應12 h，取反應后混合樣品20 μL，加入適量的上樣緩沖液，然后通過Western Blot 檢測體外剪接活性，結果如圖6。TX-S1在體外條件下仍然有較高的剪接活性，而Msm-S11卻沒有任何剪接活性。

3 討論

利用斷裂蛋白質內含子對目標蛋白進行N端、C端和特異性位點標記在研究目標蛋白結構和功能等方面得到了越來越多的應用[26-28]。但是天然可利用的斷裂蛋白質內含子和1位不是半胱氨酸的蛋白質內含子都非常少。這嚴重限制了蛋白質內含子對目標蛋白N端標記的應用。本文通過數據數據庫篩選、定點突變等技術得到了HaV01 Pol、MsmDnaB-1和TX-S1 3個體內有活性的蛋白質內含子，其他蛋白質內含子沒有活性或活性太低。原因可能是原始剪接效率不是很高或改造過程中刪除了部分序列，使剩余的結構不能形成正確的折疊構象從而阻礙了剪接活動的發生。

圖5 pMMD-S11N/pTMD-S11C/pMTX-S1N/pTTX-S1C蛋白純化

蛋白質內含子體外斷裂位點的選擇并沒有統一的標準，主要是由intein的結構和性質等多種因素造成的。另外，由于intein對外顯子的同源要求較高，即使高剪接活性的斷裂蛋白質內含子，在不同的外源宿主中的剪接活性也有較大的差異。目前斷裂位點的選擇主要是和人工斷裂蛋白質內含子Ssp DnaB等比對后獲得的。但是因為intein的起源不同，比對結果很多時候氨基酸同源性很低。本文成功獲得了TX-S1(C1/S)N端無半胱氨酸的斷裂蛋白質內含子，且N端外顯子為GGS，增加了該內含子的通用性和廣泛性。我們仍希望在HaV01 Pol中尋找多個有活性的斷裂位點，同時對MsmDnaB-1做更多的分析和研究，探索III型斷裂蛋白質內含子在蛋白標記中的應用。

A：pMMsm-S11N和pTTX-S11C在體外沒有剪接活性，幾乎全部都是C末端斷裂；B：pMTX-S1N和pTTX-S1C在體外條件下可以發生體外剪接反應，但是會有部分C端斷裂的發生，不過這些并不影響后續標記的應用

圖6Msm-S11和TX-S1斷裂蛋白質內含子體外剪接

Figure 6Trans-splcing activity of Msm-S11 和TX-S1 in vitro

接下來，我們將純化TX-S1(C1/S)N端蛋白，用半胱氨酸染料標記N端，然后和TX-S1C-T在體外進行剪接反應，用SDS-PAGE、Western Blot、熒光掃描儀等檢測剪接和標記效果。同時對TX-S1(C1/S)體外剪接條件如溫度、DTT濃度和尿素濃度等進行優化，擴大其對不同蛋白的適應能力。另外，其還可以應用到蛋白結晶、蛋白純化和蛋白連接等方面。因此我們的研究為蛋白質N端標記提供了一個高剪接效率的N端無半胱氨酸斷裂蛋白質內含子，或潛在的斷裂蛋白質內含子。這將進一步擴大了斷裂蛋白質內含子在化學生物學和生物技術中的應用。