“天然植物抗菌液”(PAMs)對肝癌HepG2細(xì)胞的抑制作用及初步分子作用機(jī)制

袁雪， 邱槿怡， 王思怡， 豆榮昆， 向飛丹州， 楊飄， 茆燦泉

(1. 西南交通大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 成都 610031; 2. 云南民族醫(yī)藥研究所有限公司， 昆明 650228)

肝癌是一類嚴(yán)重危害人類生命的重大疾病。FoxM1的過量表達(dá)與肝癌的侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥、預(yù)后不良密切相關(guān)，其被認(rèn)為是癌癥的致命傷和可作為肝癌預(yù)后和治療的潛在生物標(biāo)志物[1-3]。中藥和民族醫(yī)藥是中華民族優(yōu)秀文化的傳承瑰寶，可望在包括肝癌在內(nèi)的多種重大疾病的預(yù)防和治療中發(fā)揮重要的作用。“天然植物抗菌液”(Natural plant antimicrobial solution，PAMs)是云南民族醫(yī)藥研究所股份有限公司從紅花、紫草、刺天茄、蕓香草等多種民間和傳統(tǒng)中草藥中提取制備的一種復(fù)方產(chǎn)品，2015年其升級產(chǎn)品“紫蕓解毒止痛酊”獲批云南省醫(yī)院制劑(Z20150009)。前期研究發(fā)現(xiàn)，PAMs對白血病、銀屑病、炎癥等多種疾病具有廣泛的生物學(xué)活性與作用[4]，但其對肝癌細(xì)胞的作用、尤其是體內(nèi)活性和分子作用機(jī)制尚不清楚。本文通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究，并結(jié)合FoxM1的表達(dá)調(diào)控和凋亡作用分析，初步揭示PAMs對HepG2細(xì)胞的作用效果和分子機(jī)制，旨在為PAMs的進(jìn)一步開發(fā)利用提供前期工作基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 PAMs的制備

PAMs由云南民族醫(yī)藥研究所有限公司生產(chǎn)和提供，產(chǎn)品酒精含量為50%。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2細(xì)胞培養(yǎng)在含10% FBS(Hyclone)和2%抗生素(100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素，Hyclone)的DMEM培養(yǎng)基(Gibco)中，并置于37 ℃和5% CO2的濕潤細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞活力測定

3×103個/孔HepG2細(xì)胞鋪于96孔板(Corning)中，培養(yǎng)24 h后，不同濃度的PAMs進(jìn)行處理。24 h或48 h后，加入10 μL CCK-8并孵育1.5 h。酶標(biāo)儀(Bio-Tek)450 nm波長檢測樣品吸光度值。相對抑制率(%)=(實(shí)驗(yàn)組平均吸光度值/對照組平均吸光度值)×100%。

1.4 Western blotting實(shí)驗(yàn)

收集HepG2細(xì)胞并提取總蛋白。蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(Solarbio)，5%脫脂牛奶封閉，一抗[FoxM1兔單抗(1∶ 1000，Proteintech)；p53小鼠單抗(1∶ 500，Santa Cruz)；Bcl-2兔多抗(1∶ 500，Elabscience)；GAPDH單抗(1∶ 10 000，Proteintech)]、二抗孵育，最后，增強(qiáng)型ECL(ThermoFisher)化學(xué)發(fā)光檢測。GAPDH為內(nèi)參對照。

1.5 qRT-PCR

TRIzol試劑提取HepG2細(xì)胞的總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(ThermoFisher)將RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA。用SYBR Green Master Mix試劑盒(Roche)進(jìn)行qRT-PCR測定。94 ℃變性3 min，之后40個擴(kuò)增循環(huán)如下：94 ℃變性30 s，60 ℃ 退火20 s，72 ℃延伸10 s。GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參。相關(guān)基因的引物設(shè)計見表1。

表1 相關(guān)基因的qRT-PCR引物

1.6 裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)

24只雄性BALB/c裸鼠(4～6齡)購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物科技有限公司。隨機(jī)挑選6只裸鼠作為預(yù)處理組并用PAMs每天于左腋涂搽2次。一周后， 24只裸鼠于左腋下接種2×106個HepG2細(xì)胞。造模后，除PAMs預(yù)處理組外，其余裸鼠隨機(jī)分為3組(酒精對照組、PAMs處理組和5-氟尿嘧啶(5-FU，金耀藥業(yè))陽性藥物對照組)。后續(xù)處理中，PAMs和酒精各一天涂搽2次，每次100 μL每只；5-FU每2 d 20 mg/kg的劑量進(jìn)行瘤內(nèi)注射。每2 d測定體重并于22 d后處死裸鼠，采血和分離瘤體用于后續(xù)研究。游標(biāo)卡尺測量裸鼠的腫瘤體積，V=長度×寬2/ 2。

1.7 組織學(xué)和免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)

腫瘤組織用4%多聚甲醛固定和石蠟包埋,病理切片用蘇木精-伊紅染色并光學(xué)顯微鏡觀察。免疫組織化學(xué)染色則將制備好的腫瘤切片進(jìn)行脫蠟和水化處理，并依次一抗、二抗共孵育。腫瘤切片用DAB和蘇木精進(jìn)行染色，中性樹膠封片，最后光學(xué)顯微鏡下觀察和拍攝。Image-Pro Plus 6圖像分析軟件(Meyer)分析蛋白表達(dá)。

1.8 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

Caspase檢測試劑盒(凱基生物)測定PAMs對細(xì)胞凋亡的影響。用預(yù)冷的裂解液裂解細(xì)胞，離心并保留上清液，加入反應(yīng)緩沖液，然后分別與不同的caspase底物孵育。最后用酶標(biāo)儀在405 nm處檢測caspase3、caspase8和caspase9的活性。

TUNEL凋亡檢測試劑盒(Roche)檢測裸鼠移植瘤的細(xì)胞凋亡。腫瘤切片脫蠟并用蛋白酶K處理，切片與TdT和dUTP共孵育，經(jīng)過氧化氫處理后，DAB和蘇木精染色，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察和拍攝。

1.9 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19軟件(IBM)，所有圖像均由Origin 8軟件(OriginLab)生成。Studentt檢驗(yàn)評價兩組間的統(tǒng)計學(xué)差異，P<0.05為顯著差異。圖中均值和標(biāo)準(zhǔn)差由3個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)計算得到，與對照組相比，顯著性差異P<0.05，P<0.01和P<0.001分別標(biāo)記為*、**和***。

2 結(jié)果

2.1 PAMs抑制HepG2細(xì)胞的活力并誘導(dǎo)凋亡

CCK-8法測定結(jié)果顯示，隨著PAMs濃度和作用時間的增加，PAMs對HepG2細(xì)胞的抑制作用逐漸增強(qiáng)，4%的PAMs處理24 h即可達(dá)到60%以上的抑制效率，見圖1-A。與對照組相比，PAMs處理HepG2細(xì)胞24 h、48 h后顯著提高凋亡相關(guān)的caspase3、caspase8和caspase9的酶活(圖1-B、C)。qRT-PCR和Western blotting的測定顯示，與預(yù)期一致，PAMs處理后，p53上調(diào)、Bcl-2下調(diào)(圖1-D、E、F)。以上結(jié)果揭示PAMs促進(jìn)HepG2細(xì)胞的凋亡。

2.2 PAMs下調(diào)HepG2細(xì)胞中FoxM1的表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示，4% PAMs處理HepG2細(xì)胞24 h和48 h后，F(xiàn)oxM1基因的表達(dá)顯著降低(圖2-A)。并且，PAMs顯著降低FoxM1蛋白的表達(dá)(圖2-B、C)。為此，我們推測，PAMs對肝癌的抑制作用與FoxM1的基因和蛋白表達(dá)量下調(diào)相關(guān)。

A： CCK-8測定細(xì)胞活力； B、C：4% PAMs作用24 h、48 h后caspase3、caspase8和caspase9酶活測定；D： qRT-PCR檢測4% PAMs處理HepG2細(xì)胞24 h、48 h后p53、Bcl-2基因的表達(dá)；E、F： Western blotting檢測4% PAMs處理HepG2細(xì)胞24 h、48 h后p53、Bcl-2蛋白的表達(dá)

圖1PAMs抑制HepG2細(xì)胞的活力并促進(jìn)凋亡

Figure 1 PAMs inhibited the cell viability and promoted the apoptosis of HepG2 cells

A：qRT-PCR檢測FoxM1的基因表達(dá)；B、C： Western blotting 檢測FoxM1的蛋白表達(dá)

圖2PAMs抑制FoxM1的表達(dá)

Figure 2 PAMs inhibit the expression of FoxM1

2.3 PAMs抑制HepG2裸鼠移植瘤的生長

如圖3-A所示，酒精組腫瘤體積明顯大于其他組，但PAMs預(yù)處理組、PAMs組和5-FU組之間的腫瘤體積差異無統(tǒng)計學(xué)意義。所有模型中，酒精組的腫瘤體積最大，而PAMs預(yù)處理組的腫瘤體積最小(圖3-B)，腫瘤體積與腫瘤重量變化趨勢基本一致(圖3-C)。HE染色顯示，PAMs預(yù)處理組、PAMs組和5-FU組的腫瘤切片中出現(xiàn)大量的細(xì)胞壞死，破碎和細(xì)胞核溶解(圖3-D)。此外，如圖3-E所示，PAMs預(yù)處理組、PAM組和5-FU組的腫瘤切片中出現(xiàn)了大量的陽性凋亡細(xì)胞，表明PAMs能促進(jìn)移植瘤細(xì)胞的凋亡。另外，caspase3和caspase9蛋白的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果進(jìn)一步證明了PAMs能夠促進(jìn)移植瘤細(xì)胞凋亡(圖4-A、B、C)。此外，PAMs處理顯著下調(diào)移植瘤細(xì)胞中FOXM1的基因表達(dá)量(圖4-D)。綜合以上結(jié)果，PAMs可通過下調(diào)FoxM1的表達(dá)、促進(jìn)細(xì)胞凋亡從而抑制裸鼠移植瘤HepG2細(xì)胞的生長。

A： 瘤體照片； B：移植后每3 d計算裸鼠移植瘤的腫瘤體積；C： 瘤體重量測定；D：瘤體HE染色；E：TUNEL測定腫瘤凋亡

圖3PAMs抑制HepG2細(xì)胞移植瘤的生長并誘導(dǎo)凋亡

Figure 3 PAMs inhibited the tumor growth and induced apoptosis of HepG2 xenografts

A： caspase3、caspase9免疫組化染色；B、C: caspase3和caspase9免疫組化結(jié)果分析，IOD為積分光密度；D: qRT-PCR檢測FoxM1基因表達(dá)

圖4移植瘤體caspase3、caspase9和FoxM1表達(dá)檢測

Figure 4 The expression of caspase3, caspase9 andFoxM1 in xenografts

3 討論

本研究中，細(xì)胞活性檢測結(jié)果表明，PAMs可顯著抑制HepG2細(xì)胞活力。鑒于細(xì)胞凋亡是腫瘤細(xì)胞死亡的重要途徑，為此，首先對PAMs是否可以促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測。與預(yù)期一致，PAMs可增強(qiáng)凋亡效應(yīng)基因caspase3、caspase8和caspase9的表達(dá)，同時上調(diào)p53、下降Bcl-2的表達(dá)。作為重要腫瘤抑制因子，p53通過抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[5-6]，而作為癌基因的Bcl-2，通過調(diào)控增殖和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)來抑制細(xì)胞凋亡[7-8]。以上結(jié)果確認(rèn)了PAMs對HepG2細(xì)胞的促凋亡作用。

高表達(dá)的FoxM1通過參與細(xì)胞增殖等在內(nèi)的多種生物過程導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[9-10]。此外，F(xiàn)oxM1一直被認(rèn)為是包括各種中藥提取物在內(nèi)的多個抗癌藥物的治療靶標(biāo)。從木蘭屬植物中提取的和厚樸酚 (Honokiol) 作為FoxM1的拮抗劑抑制FoxM1的表達(dá)并同時抑制FoxM1對下游基因的轉(zhuǎn)錄作用[11]。另外二芳基庚烷 (Diarylheptanoids) 通過調(diào)控FoxM1信號通路下調(diào)FoxM1及其下游基因的表達(dá)抑制胰腺癌的生長[12]。因此，通過qRT-PCR和Western blotting檢測PAMs誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡是否與FoxM1表達(dá)量改變相關(guān)。結(jié)果顯示PAMs處理HepG2細(xì)胞后同時降低了FoxM1基因和蛋白的表達(dá)。為此，我們初步推斷PAMs可能通過下調(diào)FoxM1的表達(dá)，從而抑制肝癌HepG2細(xì)胞的活力并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

通過裸鼠移植瘤模型進(jìn)一步探究體外涂搽PAMs的抗腫瘤作用與分子機(jī)制。裸鼠移植瘤表明PAMs處理能顯著地抑制裸鼠移植瘤的生長。與體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，病理組織切片HE染色、TUNEL實(shí)驗(yàn)和免疫組織化學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了PAMs能誘導(dǎo)移植瘤中HepG2細(xì)胞的凋亡。同時，PAMs處理降低了裸鼠移植瘤模型中的FoxM1的表達(dá)，這也與文獻(xiàn)報道下調(diào)FoxM1的表達(dá)能顯著地抑制肝癌細(xì)胞移植瘤的生長相一致[13-15]。此外，我們近期的研究證明了下調(diào)FoxM1的表達(dá)能強(qiáng)烈地抑制肝癌HepG2細(xì)胞在體外和體內(nèi)的生長[16]。以上結(jié)果綜合揭示PAMs可能通過下調(diào)FoxM1的表達(dá)來抑制移植瘤的生長并促進(jìn)凋亡。

需要特別指出的是，體外涂搽PAMs頻率和劑量的增加可望更有效地增強(qiáng)PAMs的功效。鑒于PAMs以上生物學(xué)活性和分子作用機(jī)制，以及體外涂搽給藥的相對安全的處理方式，我們認(rèn)為PAMs可望成為肝癌等疾病安全、有效和方便的候選藥物。在組學(xué)等系統(tǒng)生物學(xué)層面的影響與分子機(jī)制以及作用功效的進(jìn)一步提高方面，尚有待進(jìn)一步深入研究。