紅曲霉LovD基因的克隆及轉基因高產洛伐他汀菌株篩選

沈小瑞， 王鈺， 陳達偉

(安徽大學 資源與環境工程學院， 合肥 230601)

紅曲霉(Monascusspp.)在中國的應用有著很久遠的歷史，在工業、食品、醫學等方面都占據著重要作用[1-3]。紅曲霉可產多種對人體有益的次生代謝產物，如γ-氨基丁酸、麥角甾醇、洛伐他汀等。其中洛伐他汀是當今世界治療高血脂癥的有效藥物之一，具有多種藥理作用[4-6]。常見產洛伐他汀真菌有紅曲霉，土曲霉與青霉菌，但產量不適宜大規模生產，提高洛伐他汀的產量具有重要意義。酰基轉移酶LovD是洛伐他汀的生物合成中一個重要酶， LovD 催化 Monacolin J(洛伐他汀前體物)進行轉酰基作用，合成洛伐他汀[7]。所以研究LovD基因對洛伐他汀的生物合成具有重要意義[8]。

根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)是一種革蘭氏陰性菌[9]，有將自身部分DNA轉移到宿主基因組中的能力，在基因工程和分子生物學基礎研究中具有重要作用[10]。De Groot等[11]利用根癌農桿菌轉化黑曲霉，為絲狀真菌的遺傳轉化開創了新的研究方法。目前，根癌農桿菌已被成功運用于食藥用真菌、動植物致病性真菌等多種真菌的遺傳轉化。據報道，已有超過125種真菌通過此方法完成遺傳轉化[12-15]，但對紅曲霉的農桿菌遺傳轉化研究相對較少。

本研究以紫外誘變后得到的高產洛伐他汀菌株M120-1為出發菌株，通過RT-PCR技術克隆LovD基因序列，構建過量表達載體，使用根癌農桿菌介導紅曲霉遺傳轉化，篩選陽性菌株，通過高效液相色譜法篩選高產洛伐他汀菌株，并對其進行遺傳穩定性分析，以期為研究紅曲霉產洛伐他汀分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

紅曲霉M120-1由本學院資源植物保護與利用研究組通過紫外誘變篩選及保存[16]。大腸桿菌DH5α、根癌農桿菌由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑

洛伐他汀標準品購自Sigma公司。TaqPlus酶、膠回收試劑盒購自上海生工。pMD18-T載體、pRI101-AN表達載體(啟動子為 CaMv 35S，終止子為 NOS)購自TaKaRa公司。乙酰丁香酮，卡那霉素等均為分析純，購于上海生工公司。PCR引物由上海生工合成。

1.1.3 培養基

PDA培養基：稱取200 g土豆切塊，煮沸30 min后加入2% 葡萄糖，1% 瓊脂粉，定容至1 L，pH值自然， 121℃高壓滅菌30 min。

液體發酵培養基：100 mL甘油，20 mL玉米漿，10 g硝酸鈉，10 g乙酸鈉，5 g甲硫氨酸，5 g KH2PO4，2 g MgSO4·7H2O，定容至1 L，pH值自然， 121℃高壓滅菌30 min。。

1.2 試驗方法

1.2.1 紅曲霉總RNA提取及cDNA第一鏈合成

稱取1 g紅曲霉，加入 1 mL RNAiso Reagent，振蕩混勻，4 ℃ 12 000 r/min，離心 5 min。吸取上清液平均分至 2個離心管中。加入 1/5 體積的氯仿。乳化靜置后離心，加入等體積的異丙醇，混勻靜置后離心，加入 75%的乙醇 1 mL，搖勻離心，棄去乙醇。RNA沉淀的清洗，待 RNA 沉淀完全溶解后于-80 ℃保存。1.5%甲醛變性凝膠電泳檢測。

RT-PCR反應體系:上樣緩沖液4 μL，RNA 2 μL，隨機引物1 μL，反轉錄酶1 μL，去RNA 酶水12 μL，共20 μL，37 ℃ 15 min。

1.2.2 表達載體構建

膠回收試劑盒回收純化PCR產物，進行連接轉化。將回收、純化后得到的目的片段與pRI101-AN表達載體進行過夜連接。熱刺激轉化感受態細胞，藍白斑法篩選陽性菌株，將克隆片段交由上海生工進行測序。把帶有LovD基因的質粒，整合進根瘤農桿菌中，采取PCR檢測分析轉化菌株。

1.2.3 紅曲霉遺傳轉化

將紅曲霉菌株接種至PDA培養基，30 ℃培養15 d后，制備孢子懸液，用無菌水將孢子稀釋濃度為1×105個/mL。誘導培養農桿菌時誘導劑乙酰丁香酮(AS)濃度為140 μmol/L，根癌農桿菌的OD600值為0.6，農桿菌和紅曲霉孢子于30 ℃共培養3 d。對其紅曲霉LovD基因進行遺傳轉化共得到1000個左右的轉化子，隨機挑選12個轉化子進行PCR檢測。

1.2.4 高產洛伐他汀菌株篩選

取2 mL發酵液于6 mL乙酸乙酯中，超聲30 min，6000 r/min，離心10 min。將上清液于微孔濾膜過濾， HPLC檢測分析。檢測條件：波長238 nm，梯度洗脫，進樣量10 μm，柱溫35 ℃，流動相：乙腈和0.1%磷酸緩沖液。標準曲線方程為y=3×10-8x+0.003 (R2=0.9968)，其中x表示峰面積，y表示為濃度mg/mL。

1.2.5 遺傳穩定性分析

將篩選出的高產洛伐他汀轉化菌株連續培養9代，測定1、3、5、7及9代的洛伐他汀產量，以其產量為標準檢測其遺傳穩定性。

2 結果與分析

2.1 紅曲霉總RNA提取

圖1 紅曲霉總RNA主要脂糖凝膠電泳

吸取1 μL紅曲霉總RNA樣品，用1.5%甲醛變性凝膠電泳檢測，總RNA的3條帶非常明亮，其中28S rRNA和18S rRNA兩個條帶亮度好，條帶邊緣比較分明，且28S rRNA大概為18S rRNA的兩倍的亮度，說明提取的質量較高，沒有降解和DNA污染，滿足用來進行后續實驗。

2.2 紅曲霉轉化子的PCR鑒定

(Marker：GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder, 75、 200、 300、 400、 500、 700、 1000、 1500、 2000、 3000、 4000、 5000、 7000、 10 000、 20 000 bp)

圖2紅曲霉轉化子的PCR鑒定結果

Figure 2 PCR assay results ofMonascustransformants

根據遺傳轉化體系獲取轉化子1000個左右，隨機挑選12個轉化子，1-14分別代表：水，原始菌株，MD-1，MD-2，MD-3，MD-4，MD-5，MD-6，MD-7，MD-8，MD-9，MD-10，MD-11，MD-12進行PCR鑒定，如圖所示，12個轉化子中有10個出現條帶，水和原始菌株中沒有出現明顯的條帶，故得到證明T-DNA成功導入到紅曲霉基因組中。

2.3 紅曲霉洛伐他汀的產量測定

表1 紅曲霉洛伐他汀的產量測定

注：P≤0.05

對初步篩選的10個轉化子進行培養，30 ℃培養7 d，通過HPLC測定洛伐他汀產量，方差分析結果如表1所示，其中9株的洛伐他汀產量高于出發菌株[16]，且MD-5的產量最高，與其他9個菌株在P≤0.05表現出顯著性差異。MD-5的洛伐他汀產量為0.55 mg/mL，比出發菌株高出63%。

2.4 轉化菌株遺傳穩定性

對洛伐他汀產量最高的紅曲霉轉化菌株MD-5進行傳代培養，分析其遺傳穩定性，結果如表2所示，子代相對于第 1 代產量略有下降，但每組之間以及和一代對比沒有表現出顯著性差異，基本保持產量的穩定性， MD-5轉化菌株表現出良好的穩定性。

表2 高產洛伐他汀菌株的穩定性分析

3 討論

常見產洛伐他汀真菌有紅曲霉、土曲霉與青霉菌，但其產量都不是很高，并不適宜進行大規模生產。目前已通過菌種改良、發酵工藝優化及基因工程技術等方法提高洛伐他汀產量[17-18]。

通過根癌農桿菌介導的紅曲霉遺傳轉化，獲得的MD-5菌株洛伐他汀產量為0.55 mg/mL。根瘤農桿菌導入的LovD過量表達載體是否與染色體發生重組，或形成獨立的質粒有待進一步研究。