響應面法優化重組大腸桿菌產谷氨酸脫氫酶培養基的研究

張雨晴， 尹新堅， 吳堅平, 楊立榮

(浙江大學 工業生物催化浙江省工程實驗室， 杭州 310027)

谷氨酸脫氫酶(Glutamate dehydrogenase，GluDH, EC 1.4.1.2-1.4.1.4)是一類依賴煙酰胺類輔酶NAD(P)+/NAD(P)H的氧化還原酶[1-4]，能夠可逆的將谷氨酸氧化脫氨生成α-酮戊二酸。該酶主要以四聚體和六聚體兩種形式廣泛存在于各種動植物、微生物體內[5-7]，在碳、氮代謝中起著至關重要的作用。GluDH在臨床及農業、工業領域具有非常廣泛的應用[8]，同時為酶學性質研究提供了豐富的素材[9-10]。在有機合成領域，GluDH 在天然及非天然氨基酸制備方面同樣表現出巨大的應用潛力，GluDH催化合成氨基酸類化合物原理如圖1所示。與化學法相比，利用GluDH等酶合成光學純的天然及非天然氨基酸[11-13]，具有高效、環保、安全及立體選擇性高等一系列優點，是符合綠色先進生產理念的先進制造技術。草銨膦(4-[羥基(甲基)膦酰基]-DL-高丙氨酸)是一種含磷的氨基酸類除草劑，具有農作物安全、活性高、殺草譜廣、藥害小等優點，是目前轉基因抗性作物理想的除草劑，應用前景十分廣闊[14-16]。前期工作中，本實驗室已經開發出一株能夠胺化還原2-羰基-4-(羥基甲基膦酰基丁酸)(PPO)合成 L-草銨膦的重組谷氨酸脫氫酶。為推進該工藝的工業化應用，還需優化培養基來降低生物催化劑的制備成本。

重組大腸桿菌培養基優化方法主要包括單因素試驗法[17]、正交設計試驗法[18-19]、均勻設計法[20]以及響應面設計優化法[21-25]等。其中響應面設計優化法具有試驗周期短，求得的回歸方程精度高，能研究幾種因素間交互作用等優點，是一種優化反應條件和工藝參數的有效方法[26]。本文首先采用單因素試驗，確定發酵培養基中最適的碳、氮源，再利用Plackett Burman設計確定培養基中影響顯著的因子。在此基礎上利用最陡爬坡實驗確定顯著因子的適宜濃度范圍，并根據Box-Bohnken的中心組合設計實驗和響應面分析確定最優的發酵培養基配方，為工業化生產提供參考。

圖1 谷氨酸脫氫酶合成氨基酸類化合物示意圖

1 材料與方法

1.1 菌株和培養基

菌株：產GluDH重組菌由本實驗室保藏，該GluDH基因來源于Pseudomonasputida，表達載體為pET-28a(+)，宿主為E.coliBL21(DE3)。

培養基：重組菌種子LB培養基(g/L)，酵母粉 5，胰蛋白胨 10，NaCl 10，調pH值至7.0;原始液體發酵培養基(g/L)：Na2HPO4·12H2O 17.1，KH2PO43.0，NaCl 0.5，NH4Cl 1.5，MgSO4·7H2O 0.1，甘油5，酵母粉10;各培養基根據需要添加終濃度為50 mg/L的卡那霉素。

1.2 試劑

2-羰基-4-(羥基甲基膦酰基)丁酸(PPO)為實驗室自制；分析級酵母粉和蛋白胨均為OXOID公司產品；工業級酵母粉為安琪酵母股份有限公司產品。其余試劑為國產分析純。

1.3 發酵培養

種子培養：挑取平板上劃線的重組大腸桿菌單菌落接種至種子培養基，37 ℃、200 r/min振蕩培養7～8 h。

發酵培養：將培養好的種子液按2%的轉接量轉接至含50 mg/L卡那霉素的50 mL液體培養基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養3～4 h至OD600達到1.0時加入終濃度為0.5 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，18 ℃誘導14～16 h。收集發酵液4 ℃、12 000 r/min離心收集菌體，用pH 7.5的磷酸鹽緩沖液重懸后破胞取上清液測酶活。

1.4 GluDH活力測定

高效液相色譜法檢測L-草銨膦的生成量。

1.5 響應面法優化培養基組成

1.5.1 Plackett-Burman 設計[27]

通過Plackett-Burman試驗來確定發酵培養基中影響酶活的主要組分因素。選用N=12的PB設計，每個因素分別取高、低兩個水平，高水平取低水平的1.25倍，響應值為每毫升發酵液中谷氨酸脫氫酶的酶活。

1.5.2 響應面試驗設計[28]

根據Box-Benhnken的中心組合實驗設計原理，進一步進行三因素三水平的響應面分析實驗，實驗數據用Design Expert 軟件經多項式回歸分析，并對擬合方程做顯著性檢驗，其統計學上的顯著性由F檢驗確定。

2 結果與分析

2.1 最適碳源、氮源的選擇

碳源的選擇：以10 g/L的安琪酵母粉905作為氮源，在碳源濃度為5 g/L時對液體發酵培養基中的碳源進行篩選，實驗結果見圖2。由圖2可知以甘油為碳源時的酶活力和OD600最高，分別為82.3 U/mL和6.81，表明甘油是最適碳源。

1:蔗糖；2:果糖；3:可溶性淀粉；4:葡萄糖；5:木糖；6:甘油

圖2不同碳源下的酶活力和OD600

Figure 2 Enzyme activity andOD600for different carbon source

氮源的選擇：以5 g/L的甘油作為碳源，在氮源濃度為10 g/L時對氮源進行篩選，實驗結果見圖3。由圖3可知，以OXOID公司的酵母粉(分析級)為氮源時，酶活力和生物量OD600最高，安琪酵母粉905(工業級)為氮源時的酶活和生物量次之，考慮到安琪酵母粉在價格上有顯著優勢，因此采用安琪酵母粉作為氮源。

2.2 Plackett-Burman 篩選影響產酶的重要因素

在單因素優化實驗結果的基礎上，對培養基的7種組分(X1-甘油、X2-Na2HPO4·12H2O、X3-KH2PO4、X4-NaCl、X5-NH4Cl、X6-酵母粉、X7-MgSO4·7H2O)進行PB重要性篩選，實驗設計與結果如表1所示。

利用Design Expert軟件對各因素的主效應進行分析，結果見表2。由表2的分析結果可知，酵母粉(X6)、甘油(X1)和MgSO4·7H2O(X7)這3種因素的Prob>F值均小于0.05，表明這3種因素對產酶的影響極顯著。另外模型方差分析的可信度R2=96.61%，證明該模型顯著性極高,可對本研究模擬進行較好地解釋。

1:酵母粉(OXOID)；2:胰蛋白胨(OXOID)；3:安琪酵母粉(905)；4:牛肉膏；5:大豆蛋白胨；6:骨蛋白胨；7:魚蛋白胨

圖3 不同氮源下的酶活力和OD600

表2 Plackett-Burman 試驗因素水平及效應

2.3 最陡爬坡試驗設計

對PB實驗結果確定的3種顯著性試驗因素進行爬坡實驗，使其濃度盡量靠近最佳水平值區域，試驗設計及結果如表3所示。由結果可見，酶活隨著各組分濃度的升高先增大后減小，酶活最高值在第4組與第5組實驗之間，并且第4組的酶活較之更高，所以以第4組的條件作為最佳因素質量濃度的組合并作為下一步響應面實驗的中心點，即酵母粉16 g/L、甘油11 g/L、MgSO4·7H2O 0.8 g/L，并根據上述結果，確定響應面試驗中3種試驗因素的3個水平值。

表3 最陡爬坡試驗設計及其結果

2.4 Box-Behnken試驗設計及結果

采用三因素三水平的Box-Behnken響應面分析法進一步對培養基進行優化，因素水平見表4，試驗結果表見表5。

表4 響應面分析試驗因素及水平

表5 培養基組成Box-Behnken試驗設計和結果

2.5 模型方程的建立與方差分析

運用構建好的二階經驗模型來進行分析。對試驗模型進行二階回歸擬合，得到回歸方程為：

表6 Box-Behnken試驗設計結果方差分析

注：“**”表示差異極顯著，P<0.01；“*”表示差異顯著，P<0.05；“—”表示差異不顯著，P>0.05

模型的響應面圖及其等高線圖各變量與變量之間對響應值的影響，等高線圖還可揭示出各變量之間交互作用的顯著性[29]。在硫酸鎂(X3)濃度保持固定的情況下，酵母粉(X1)與甘油(X2)對產酶的影響，如圖4所示，圖5與圖6同理。

圖4 響應面法(X1，X2)立體分析及等高線圖

2.6 重組大腸桿菌產GluDH最優培養基成分的確定

對模型方程進行典型性分析說明，模型存在最優的極值條件，即在相應曲面的最高點處，通過分析可以得到GluDH的最大產出和各顯著因素添加的最佳質量濃度：安琪酵母粉905 16.28 g/L，甘油11.3 g/L，MgSO4·7H2O 0.63 g/L，預測GluDH 活力的最大值為129.3 U/mL。

為證明模型預測的準確性，進行3次平行最優條件下的重復試驗，結果分別為128.7、128.9和129.6 U/mL，平均值為129.1 U/mL，與模型方程預測結果基本一致，這說明模型方程真實可行，能夠很好地預測實際的發酵結果。

圖5 響應面法(X1，X3)立體分析及等高線圖

圖6 響應面法(X2，X3)立體分析及等高線圖

3 討論

響應面優化法是將數學方法與統計方法相結合，尋求多因素系統中的最佳條件，對受多個變量影響的響應問題進行建模與分析，縮短優化時間，提高應用的可信度。該方法實驗次數少，周期短，精度高，已成功地應用于其他發酵培養基的優化，但目前還未有將該方法應用于谷氨酸脫氫酶重組菌的發酵培養的報道。首先通過單因素試驗對發酵培養基中最適的碳源和氮源進行篩選，從工業生產成本和酶活兩個角度考慮，以甘油作為碳源和以安琪酵母粉905作為氮源能獲得較高的酶活，并且具有價格優勢，能顯著降低工業化生產的成本。

不同的培養基成分及含量對酶活有不同程度的影響，因此選擇通過Plackett-Burman設計結果分析確定對酶活影響顯著的培養基成分，對培養基中的不同組分分別設計高、低兩個不同水平(高水平為低水平的1.25倍)，通過Design Expert軟件設計實驗，以酶活為響應值，對實驗結果進行方差分析，由P值可知影響顯著的3個因素分別為安琪酵母粉905、甘油和MgSO4·7H2O。為了進一步逼近響應值酶活的最佳區域，確定響應面實驗點的取值范圍，設計最陡爬坡實驗得到酶活的變化趨勢，并確定一組最高的酶活所對應的培養基組分濃度作為響應面實驗的中心點。最后對響應面實驗結果進行建模和方差分析，得到二階回歸方程，分別對3個因素一次項、二次項和交互項影響的顯著性進行分析，得到酵母粉和甘油的一次項和二次項均影響顯著，交互項影響不顯著，即各因素之間交互作用的影響較小。同時可得到響應面圖及對應的等高線圖，從各等高線圖可知，各自變量因素之間的交互作用不顯著，從響應面圖可知最大橢圓表示在該圓上取值，酶活最低，產量最小；而最小橢圓取值，酶活最高，產量最大，大小橢圓之間酶活逐漸遞進。對模型進行分析，酶活的最優值在曲面的最高處取得，得到預測最高值為129.3 U/mL，通過實驗驗證，所得的酶活值與預測值基本一致，說明模型有效可靠。

本文采用的是Plackett-Burman試驗設計和響應面分析法結合對發酵培養基進行優化，目前還未有將該方法應用于谷氨酸脫氫酶重組菌的發酵培養的報道。通過響應面確定最佳的培養基配方為：甘油11.3 g/L，安琪酵母粉905 16.28 g/L，MgSO4·7H2O 0.63 g/L，Na2HPO4·12H2O 17.1 g/L， KH2PO43 g/L，NH4Cl 1.5 g/L，NaCl 0.5 g/L。采用優化后的培養基，搖瓶發酵產谷氨酸脫氫酶的酶活達到129.1 U/mL，是LB培養基酶活的2.58倍。結果證明Plackett-Burman和響應面法結合的試驗統計方法能比較快速地找出顯著的影響因素，并實現培養基組分優化，優化結果與實際發酵條件吻合良好，谷氨酸脫氫酶產量提高顯著。本試驗成功地提高了谷氨酸脫氫酶的生產效率，為胺化還原制備L-草銨膦的工業化應用奠定了基礎。