62份非PK型紫蘇種質(zhì)的揮發(fā)油GC-MS分析和新化學(xué)型發(fā)現(xiàn)△

郭佳琪，李衛(wèi)萍，沈奇，楊森，商志偉，郭寶林*，葛菲*

1.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330006；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；3.貴州省油菜研究所，貴州 貴陽 550008

1 材料

1.1 儀器和試劑

GC-MS(ULTRA-ISQ)氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀器(Trace 1310，賽默飛世爾科技公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(N-1001，上海愛朗儀器有限公司)；分析天平(FA2014N型，上海精密科學(xué)儀器有限公司)；循環(huán)式真空泵(CA-1111，上海愛朗儀器有限公司)；冷卻水循環(huán)裝置(CA-1111型，上海愛朗儀器有限公司)；超聲波清洗器(KQ-500E型，昆山市超聲儀器有限公司)。

石油醚(分析純，北京化工廠)；正己烷(色譜純，賽默飛世爾科技公司)；無水乙醇(分析純，北京化工廠)；水為蒸餾水。

1.2 樣品來源

將收集到的800余份國內(nèi)不同來源的紫蘇種質(zhì)的種子于2017年種植于貴州省長順縣，在紫蘇營養(yǎng)生長后期主要通過葉片氣味進(jìn)行篩選，排除具有典型PK型紫蘇所特有的氣味類型的材料，選出62份紫蘇種質(zhì)，并在穗前期采收紫蘇葉，將葉材料凈選、陰干備用。樣品信息見表1。

表1 紫蘇樣品信息

2 方法

2.1 揮發(fā)油提取

紫蘇葉粉碎后過四號(hào)篩，準(zhǔn)確稱取紫蘇葉粉末50 g于圓底燒瓶中，加入蒸餾水500 mL，采用水蒸氣蒸餾法提取5 h，用20 mL石油醚萃取2次，加適量無水硫酸鈉干燥12 h，過濾后40 ℃回收石油醚，精密吸取揮發(fā)油1 μL，用正己烷定容至5 mL，備用。

2.2 GC-MS分析

色譜條件：HP-5MS 色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，載氣為氦氣，進(jìn)樣口溫度200 ℃。程序升溫：起始溫度50 ℃，10 ℃·min-1升至100℃，保留3 min，5 ℃·min-1升至200 ℃，保留3 min。分流比20∶1，進(jìn)樣1 μL。

質(zhì)譜條件：離子源為EI，70 eV，接口溫度250 ℃，質(zhì)量掃描范圍m/z50～500，溶劑延遲時(shí)間3 min。

3 結(jié)果

3.1 揮發(fā)油提取率和成分鑒定

62份紫蘇葉樣品揮發(fā)油提取率為0.02%～2.00%，其中以樣品M544的揮發(fā)油得率最高，樣品M626的得率最低。采用GC-MS對(duì)62份紫蘇葉揮發(fā)油樣品進(jìn)行分析，通過數(shù)據(jù)庫NIST 2.0進(jìn)行檢索并核對(duì)文獻(xiàn)資料，共鑒定了D-檸檬烯(D-Limonene)、芳樟醇(Linalool)、紫蘇烯(Perillene)、紫蘇酮、(-)-胡椒酮[(-)-Piperitone]、紫蘇醛(Perillaldehyde)、紫蘇醇(Perillylalcohol)、異紫蘇酮(Isoegomaketone)、石竹烯(Caryophyllene)、葎草烯(Humulene)、(Z，E)α-法尼烯[(Z，E)α-Farnesene]、肉豆蔻醚(Myristicin)、欖香素(Elemicin)、(-)-斯巴醇[(-)-Spathulenol]、氧化石竹烯(Caryophyllene oxide)、植醇(Phytol)、β-細(xì)辛腦(β-Asarone)、芹菜腦(Apiol)等30多個(gè)化合物，以面積歸一化法得到各成分的相對(duì)百分含量。具體參見表2～3。

3.2 樣品化學(xué)型分類

根據(jù)主要成分類型和相對(duì)含量確定化學(xué)型，本項(xiàng)結(jié)果呈現(xiàn)出十分多樣的化學(xué)型類型。

采用RevMan 5.1軟件進(jìn)行Meta‐分析。計(jì)數(shù)資料用比值比（OR）為效應(yīng)指標(biāo)，各效應(yīng)量均給出其點(diǎn)估計(jì)值和95%可信區(qū)間（95%CI）。采用χ2檢驗(yàn)分析各研究結(jié)果間的異質(zhì)性，當(dāng)P≥0.10，I2≤50%時(shí)，采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行Meta‐分析；反之，則采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行Meta‐分析，并謹(jǐn)慎解釋研究結(jié)果。若數(shù)據(jù)無法合并則行描述性分析。對(duì)納入研究數(shù)＞10個(gè)的結(jié)局指標(biāo)采用漏斗圖分析發(fā)表偏倚。

3.2.1 單一主成分構(gòu)成類型

3.2.1.1 PA型 PA型的紫蘇揮發(fā)油構(gòu)成以紫蘇醛為主要單萜，紫蘇醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般在45%以上，一般含有較高的D-檸檬烯，但低于紫蘇醛[4，11]，有時(shí)含少量紫蘇醇及紫蘇酮。PA型是僅次于PK型的常見單萜化學(xué)型，本次實(shí)驗(yàn)有38份PA型樣品。發(fā)現(xiàn)一種新類型，即樣品M502的揮發(fā)油中D-檸檬烯相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)39.51%，而紫蘇醛相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為29.78%，是一種新的亞型，建議命名為PA-Ⅱ型。剩余37份樣品中幾個(gè)主成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為：紫蘇醛42.16%～80.50%，D-檸檬烯0～18.55%，紫蘇醇0～3.37%，紫蘇酮0～6.92%。

3.2.1.2 PL型 PL型的成分構(gòu)成特點(diǎn)為以紫蘇烯為主要單萜[4，11]，質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般在50%以上，且含有少量反式檸檬醛和紫蘇酮。該類化學(xué)型為少見類型本次有2份樣品(M068、M267)為該型，其中紫蘇烯相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為71.65%、57.78%，紫蘇酮相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2.04%、1.28%，未檢出反式檸檬醛。

3.2.1.3 PT型 PT型的成分構(gòu)成特點(diǎn)為，以胡椒烯酮(Piperitenone)為主要單萜[4，11]，其相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般在50%以上，同時(shí)也含有較多的D-檸檬烯、少量的(-)-胡椒酮及紫蘇醛，該類型是少見類型。本次有3份樣品(M082、M386、M398)，含有較高的(-)-胡椒酮，相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為59.91%～62.37%，同時(shí)含有D-檸檬烯6.75%～17.56%和紫蘇醛1.24%～2.79%，并且不含有胡椒烯酮，與Zhang等[12]歸類為DLP型紫蘇的揮發(fā)油組成特點(diǎn)一致，從化合物次生代謝過程來看，胡椒烯酮和胡椒酮為同一個(gè)途徑的化合物，具有直接轉(zhuǎn)化關(guān)系[5]，本研究將該種化學(xué)型命名為PT-Ⅱ型的建議更為合理。

3.2.1.4 PP型 PP型指的是以芳香化合物為主要構(gòu)成成分的化學(xué)型，單萜類成分含量很低，但倍半萜類成分含量常較單萜化學(xué)型高，常見石竹烯相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過20%[11]。PP型又細(xì)分為：PP-a型，其主要成分芹菜腦，相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%以上；PP-s型，主要成分β-細(xì)辛腦，相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%以上；PP-m型，主要成分肉豆蔻醚，相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)70%以上；如兩種及以上成分兼有則定義為PP-am、PP-em、PP-emd(e代表欖香素)等。本次樣品中，有3份PP-a型(M046、M100、M516)，芹菜腦相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為55.01%、56.97%、82.97%，石竹烯相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為24.28%、27.61%、8.68%，其中M516較為特殊；1份PP-s型(M292)，β-細(xì)辛腦的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40.12%，石竹烯相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)22.65%；4份PP-m型(M438、M544、M550、M955)，M550較為特殊，肉豆蔻醚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為43.66%，石竹烯20.00%，同時(shí)含有紫蘇酮13.04%。另外3份種質(zhì)中肉豆蔻醚相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為66.99%～74.04%，石竹烯相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15.22%～25.57%。

3.2.1.5 PS型 本研究首次發(fā)現(xiàn)倍半萜成分含量很高的樣品2份(M444、M615)，建議命名為PS型(S為sesquiterpene簡(jiǎn)寫)，初步規(guī)定該化學(xué)型的特點(diǎn)為某倍半萜類成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于30%，且其他特征性成分(單萜或芳香化合物)質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于15%。M444中倍半萜類化合物氧化石竹烯的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)46.47%，命名為PS-c型；M615中倍半萜類化合物(Z，E)α-法尼烯相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)30.64%，命名為PS-f型。

表2 PA型紫蘇葉樣品揮發(fā)油得率及成分相對(duì)含量 %

續(xù)表2

注：—表示質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于0.1%；*為新發(fā)現(xiàn)化學(xué)型。

表3 幾種化學(xué)型紫蘇葉樣品揮發(fā)油得率及成分相對(duì)含量 %

續(xù)表3

注：—表示質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于0.1%；*為新發(fā)現(xiàn)化學(xué)型。

3.2.2 混合化學(xué)型 兼有兩個(gè)化學(xué)型特點(diǎn)的為混合化學(xué)型，一般兩個(gè)主成分的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)比例為2∶1～1∶2。

3.2.2.1 PAPK型 兼有PA型和PK型兩種化學(xué)型的特點(diǎn)，迄今僅在中國的種質(zhì)中發(fā)現(xiàn)[12]，本次發(fā)現(xiàn)3份樣品(M190、M548、M574)，分別含紫蘇醛16.8%、17.97%、24.90%，紫蘇酮34.66%、31.71%、14.52%，這3份種質(zhì)的倍半萜成分含量均較高，石竹烯質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為20.26%、15.81%、15.91%。

3.2.2.2 PAPT型 兼有PA型和PT型兩種化學(xué)型的特點(diǎn)，為本次新發(fā)現(xiàn)類型，1份樣品(M260)，含有紫蘇醛22.29%、(-)-胡椒酮40.98%、D-檸檬烯14.74%。

3.2.2.3 PAPP型 兼有PA型和PP型兩種化學(xué)型的特點(diǎn)，為本次新發(fā)現(xiàn)類型，1份樣品(M461)，含有紫蘇醛31.70%、芹菜腦27.08%、D-檸檬烯11.34%。

3.2.2.4 PKPP型 兼有PK型和PP型兩種化學(xué)型的特點(diǎn)，為本次新發(fā)現(xiàn)類型，1份樣品(M194-2)，含有紫蘇酮12.34%、芹菜腦29.80%、D-檸檬烯15.16%。

3.2.2.5 PAPS型 兼有PA型和PS型兩種化學(xué)型的特點(diǎn)，為本次發(fā)現(xiàn)類型，2份樣品(M447、M476)，分別含有紫蘇醛28.09%、17.36%，倍半萜類成分氧化石竹烯16.11%、24.40%。

3.2.2.6 PPPS型 兼有PP型和PS型兩種化學(xué)型的特點(diǎn)，為本次新發(fā)現(xiàn)類型，1份樣品(M295-1)，β-細(xì)辛腦和欖香素分別為19.19%、15.44%，石竹烯和葎草烯分別為32.26%、15.22%。

4 討論

本研究所用種質(zhì)材料，主要來自于紫蘇的栽培類型，其中的化學(xué)型仍然是PK型最多，PA型次之，和本研究組前期結(jié)果一致[10-11]，未能發(fā)現(xiàn)EK、C和SF等稀有化學(xué)型，而是發(fā)現(xiàn)了兩種新亞型，1份PA-Ⅱ型和3份PT-Ⅱ型。

本研究指定了以倍半萜為主要成分的類型(PS型)和含量相對(duì)較高的混合型(PAPS型和PPPS型)。倍半萜類成分在紫蘇揮發(fā)油中是普遍存在的，其中常以石竹烯含量最高，但一般不超過20%，且其他倍半萜成分較少超過10%，當(dāng)倍半萜含量特別高的時(shí)候，其他單萜或芳香性特征成分含量或者很低時(shí)為PS型，較低時(shí)且如果二者相比含量差距不大(1∶2～2∶1)時(shí)定義為混合型(PAPS型或PPPS型)，這些情況可能是來自于倍半萜代謝途徑的上調(diào)，或者單萜和芳香類成分代謝途徑的下調(diào)，是值得關(guān)注的新類型。其他新的混合型(PAPP型、PKPP型、PAPT型)的發(fā)現(xiàn)也具有重要的價(jià)值。本研究表明了中國產(chǎn)紫蘇的種質(zhì)多樣性，為紫蘇種質(zhì)的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供了珍貴的材料。