三種何首烏單體成分對大鼠肝損傷作用的研究△

顏玉靜，文海若，淡墨，呂建軍，王超，苗玉發，黃芝瑛，汪祺

1.中山大學 藥學院，廣東 廣州 510006；2.中國食品藥品檢定研究院 國家藥物安全評價監測中心/藥物非臨床安全評價研究北京市重點實驗室，北京 100176；3.中國食品藥品檢定研究院 中藥民族藥檢定所，北京 100050

蓼科植物何首烏PolygonummultiflorumThunb.的藥理學作用廣泛，包括抗腫瘤、抗菌抗炎、抗氧化、保護神經、延緩動脈粥樣硬化等[1-2]。然而近年來，國內外關于何首烏及其制劑的臨床不良反應，尤其是肝損傷的報道逐漸增多[3-4]。臨床數據提示，何首烏可導致肝細胞損傷型、膽汁淤積型及混合型的肝損傷，常見臨床癥狀為膽汁淤積、黃疸、肝區疼痛、肝脾腫大等[5]。目前何首烏中導致肝損傷的具體成分及其機制仍不明確。有研究提示其致肝損傷的機制可能與抑制膽紅素代謝過程中的UDP-葡萄糖醛酸轉移酶1A1(UGT1A1酶)有關，如汪祺等[6-7]發現大黃素型蒽醌類成分、二蒽酮及蒽酮糖苷類成分可選擇性抑制UGT1A1酶的活性，使膽紅素代謝出現障礙，在肝細胞和血液內蓄積，引發毒性。另有研究提示[8]，何首烏中的鞣質與二苯乙烯苷類成分混合后可對肝實質細胞造成不可逆的損傷。因此，有必要開展體內研究，對何首烏單體成分的肝損傷作用及可能機制進行進一步的探究。

蒽醌類和蒽酮類是何首烏中的主要單體成分。蒽醌類成分包括大黃素、大黃酸、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素甲醚等[9]。目前有關大黃素和大黃酸的致肝毒性作用研究較為充分[10]，針對大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷及大黃素甲醚的肝毒性研究，尤其是體內研究則較少。此外，二蒽酮類化合物大黃素型單蒽酮在新鮮何首烏中含量較高，也有文獻報道其在體外的致肝毒性作用[7]。本研究擬連續14 d經口灌胃給予SD大鼠大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素甲醚和單蒽酮，觀察動物臨床癥狀，分析體質量、肝臟質量、細胞因子水平、血清生化指標及病理學指標，探究3種單體成分體內的肝毒性作用及可能的機制，為研究何首烏致肝毒性提供體內數據支持。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠50只(給藥時約6周齡，體質量約200 g)，購買自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(京)2016-0006[11]。大鼠在屏障系統內PC聚碳酸酯鼠盒飼養，飼養環境保持溫度20～26 ℃，濕度40%～70%，提供鈷60放射滅菌鼠全價顆粒飼料，自由攝取。

1.2 儀器與試劑

H500FR臺式高速冷凍離心機(日本Kokusan 公司)；7180型全自動生化分析儀(日本日立公司)；PB203-N型電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；顯微鏡(日本Olympus公司)；櫻花TEC5EMJ-2型自動包埋機和DRS-2000自動染色機及封片機(日本Sakura公司)；MERCK LIMTTED Luminex 200(德國Merck Millipore 公司)。

大黃素甲醚(中國食品藥品檢定研究院，批號：110758-201616，純度：99.0%)；大黃素-8-O-葡萄糖苷(源葉生物科技有限公司，純度≥98.0%)；大黃素型單蒽酮(中國醫學科學院藥物研究所楊建波博士贈送，純度≥95%)；羧甲基纖維素鈉(美國Sigma Aldrich公司)；Milliplex Map Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel Kit(德國Merck Millipore 公司)。

2 方法

2.1 動物分組及給藥方式

動物在給藥前檢疫適應6 d。檢疫期第6天按體質量隨機分組法分為10組，每組5只動物。分組時動物體質量約200 g，個體體質量差異小于平均體質量的±20%。給藥方式為經口灌胃，連續給藥14 d，給藥劑量為15 mL·kg-1。

2.2 給藥劑量

何首烏的臨床每日最大用量約為每人100 g生藥，按體質量60 kg計算，即1.7 g·kg-1。其中大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷在生藥中含量以2.63 mg·g-1計，為4.5 mg·kg-1；單蒽酮和大黃素甲醚在生藥中含量以0.62 mg·g-1計，為1.05 mg·kg-1。根據大鼠與人體表面積系數(6.17)折算，大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷相當于28 mg·kg-1，以該劑量為最低劑量，分別設置28、280、1120 mg·kg-1劑量組，約為人最大擬用劑量的1倍、10倍和40倍；單蒽酮和大黃素甲醚相當于6.5 mg·kg-1，以該劑量為最低劑量，分別設置6.5、65、650 mg·kg-1劑量組，約為人最大擬用劑量的1倍、10倍和100倍[11]。

2.3 檢測指標

研究期間每天觀察動物臨床癥狀。給藥第1、4、8、11天及第15天解剖日麻醉前各測定1次動物體質量。動物經異氟烷麻醉后經眼眶后靜脈叢采血。剖檢前一天動物禁食過夜，第15天麻醉動物后采集腹腔后大靜脈血。給藥第2、4、8、11天和第15天采血用于進行血清生化檢測，采血量約1 mL/只。血液樣本在室溫放置1～2 h后，以4 ℃ 3500 r·min-1離心15 min，吸取血清，使用Hitachi 7180型全自動生化儀測定以下血清生化指標：天門冬氨酸氨基轉換酶(AST)、丙氨酸氨基轉換酶(ALT)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸磷酸激酶(CK)、堿性磷酸酶(ALP)、總膽紅素(TBIL)。給藥第2、第8天和第15天采血用于細胞因子測定，采血量約1 mL/只。血液樣本在室溫放置1～2 h后，以4 ℃ 3500 r·min-1離心15 min，取上清液，使用Luminex 200測定以下細胞因子水平：白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-10(IL-10)、干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)。

給藥結束后所有動物以CO2吸入法麻醉，腹腔后大靜脈取血完畢后，完全放血處死解剖，記錄大體病理學發現。將動物肝臟分離后稱質量，并使用10%甲醛固定。固定后的組織經修塊取材后逐級75%乙醇脫水，再經石蠟包埋，采用滑動切片機切片(厚約3 μm)。切片經蘇木精-伊紅(HE)染色后，在光鏡下進行組織病理學檢查[11]。

2.4 統計學方法

3 結果

3.1 整體毒性

實驗期間，各組動物臨床癥狀未見與給予3種單體相關的明顯異常改變。此外，與對照組相比，大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、單蒽酮、大黃素甲醚各劑量組動物在不同時期的平均體質量(見圖1)及肝臟質量(見表1)差異不具有統計學意義(P> 0.05)，提示按照當前的給藥方式和給藥劑量，3種單體均不會對動物整體產生嚴重的毒性作用。

圖1 受試物對SD大鼠體質量的影響

給予物質給藥劑量/mg·kg-1體質量/kg腦質量/g肝臟質量/g臟體質量比/g·kg-1臟腦質量比/g·g-10.5%羧甲基纖維素鈉264.7±27.91.893±0.12611.824±1.6940.045±0.0026.240±0.682大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷28.0262.3±20.61.941±0.07512.332±2.0250.047±0.0056.336±0.846280.0250.8±26.11.901±0.09312.454±1.7750.050±0.0036.561±0.9711 120.0238.5±28.21.907±0.07211.642±1.6780.049±0.0056.087±0.674單蒽酮6.5257.6±38.61.958±0.13512.068±2.5990.047±0.0036.123±0.96265.0260.0±27.31.920±0.07311.616±3.6530.044±0.0116.045±1.864650.0253.4±28.01.916±0.16112.245±1.3910.048±0.0036.432±0.945大黃素甲醚6.5260.3±22.71.977±0.14411.796±1.9260.045±0.0055.951±0.77965.0264.8±35.51.955±0.12212.504±3.0900.047±0.0056.341±1.157650.0257.1±29.71.983±0.08313.096±1.6900.051±0.0076.595±0.726

3.2 血清生化檢測

實驗期間分別在給藥第2、4、8、11天和第15天采外周血5次，以動態監測受試物對動物與肝臟功能相關的血清生化指標的改變，詳見表2～6。大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷和單蒽酮各劑量組的血清生化指標數值在各時間點與對照組相比均未見統計學差異(P> 0.05)，提示在當前給藥方式和給藥劑量下，大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷和單蒽酮未產生明顯的肝損傷作用。給藥后第4天，大黃素甲醚65 mg·kg-1劑量組動物TBIL的平均值與對照組相比，出現了統計學意義上的升高(P<0.05)，提示給予大黃素甲醚可一定程度誘導TBIL升高。

表2 給予受試物后第2天SD大鼠與肝臟功能有關的血清生化指標數值

注：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；下同。

表3 給予受試物后第4天SD大鼠與肝臟功能有關的血清生化指標數值

表4 給予受試物后第8天SD大鼠與肝臟功能有關的血清生化指標數值

表5 給予受試物后第11天SD大鼠與肝臟功能有關的血清生化指標數值

表6 給予受試物后第15天SD大鼠與肝臟功能有關的血清生化指標數值

3.3 組織病理學檢查

肝臟組織病理學觀察結果詳見表7。動物肝臟鏡檢大黃素甲醚650 mg·kg-1劑量組中1/5可見中度肝細胞變性壞死，其他組織病理學改變包括匯管區炎細胞浸潤(見圖2)，但均缺乏劑量效應關系，考慮與藥物作用無關。

表7 肝臟組織病理學檢查結果

3.4 細胞因子水平

細胞因子是由免疫細胞和某些非免疫細胞產生的多功能肽，具有調節血管生成、細胞生長及修復損傷細胞、組織等多種功能，主要包括：白細胞介素、干擾素、腫瘤壞死家族、趨化因子、生長因子等。IL-6是促炎介質，可刺激肝內炎癥反應[12]；IL-10是抗炎性細胞因子，可抑制肝內炎癥介質的合成和表達，減輕肝細胞損傷和炎癥反應[13]；TNF-α是前炎癥細胞因子，可誘導肝細胞大量表達細胞間黏附分子-1，使其易受細胞毒性T細胞的攻擊而大量壞死[14]；IFN-γ是炎性細胞因子，可引起肝細胞的細胞周期阻滯和細胞凋亡[15]。4種細胞因子均在肝臟疾病的發生發展過程中發揮著重要作用。

實驗期間分別在給藥第2、8天和第15天采血3次動態監測受試物對細胞因子水平的影響，詳見表8～10。給藥后第2天，與同時期對照組平均數值比較，大黃素甲醚6.5 mg·kg-1劑量組動物IL-6和TNF-α的水平出現統計學意義上的顯著升高(P<0.05)；給藥后第8天，大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷28、280、1120 mg·kg-1及單蒽酮650 mg·kg-1劑量組動物IL-10的水平降低(P<0.05)，大黃素甲醚650 mg·kg-1劑量組動物TNF-α水平升高(P<0.05)；給藥后第15天，單蒽酮65、650 mg·kg-1和大黃素甲醚6.5、65、650 mg·kg-1劑量組動物IL-10水平降低(P<0.05)，單蒽酮650 mg·kg-1劑量組動物IFN-γ的水平也顯著下降(P<0.05)。

圖2 各組大鼠肝臟鏡檢結果(HE，×200)

給予物質給藥劑量/mg·kg-1IL-6/pg·mL-1IL-10/pg·mL-1IFN-γ/pg·mL-1TNF-α/pg·mL-10.5%羧甲基纖維素鈉5.85±8.2847.61±37.821.08±1.254.48±3.32大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷28.06.26±7.9823.30±15.431.30±2.072.78±1.05280.01.87±0.8130.30±27.330.01±0.014.01±2.551 120.09.66±5.7136.22±16.830.09±0.075.09±4.61單蒽酮6.51.46±0.9431.76±16.410.08±0.162.08±0.4565.03.00±2.6541.81±28.450.01±0.013.78±2.95650.01.73±0.9427.21±20.270.00±0.004.86±3.50大黃素甲醚6.5 17.65±10.76?63.19±13.560.11±0.1823.77±1.35?65.02.27±0.0029.26±30.310.09±0.033.97±3.60650.03.24±3.1924.21±15.500.11±0.014.17±1.63

注：與對照組相比，*P<0.05；下同。

表9 給予受試物后第8天SD大鼠體內細胞因子平均含量

表10 給予受試物后第15天SD大鼠體內細胞因子平均含量

4 討論

本研究連續14 d經口灌胃給予SD大鼠28、280、1120 mg·kg-1的大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷，6.5、65、650 mg·kg-1的單蒽酮和大黃素甲醚，未見異常臨床癥狀及動物體質量和肝臟質量的明顯變化，提示當前給藥劑量下3種何首烏中重要單體成分對大鼠無明顯整體毒性作用。但血清生化指標檢測結果提示大黃素甲醚可一定程度誘導TBIL升高，大黃素甲醚650 mg·kg-1劑量組動物肝臟鏡檢可見中度肝細胞變性壞死，提示大黃素甲醚可能具有一定的肝毒性作用。

此外，實驗期間各給藥組細胞因子水平的變化也可見一些趨勢。SD大鼠連續14天給予3種單體后，抗炎性細胞因子IL-10水平均有所降低。給藥后第2天，大黃素甲醚6.5 mg·kg-1劑量組動物IL-6和TNF-α水平即顯著升高。給藥后第8天，大黃素甲醚650 mg·kg-1劑量組動物TNF-α水平升高。TNF-α是與肝臟損傷密切相關的炎癥因子，其水平升高提示肝損傷的發生。IL-6是促炎介質，可刺激肝內炎癥反應。另外，楊博[16]用膽總管結扎術模擬膽汁淤積性肝硬化，用實時定量聚合酶鏈反應和蛋白印跡檢測的方法檢測出IL-6在該疾病模型中的表達量明顯上升，提示IL-6的升高與膽汁淤積有關。王濤等[17]研究發現，何首烏在體內能夠影響膽汁代謝轉運，并引起肝損傷。本研究的結果則進一步提示，大黃素甲醚可能具有一定的肝毒性作用。給藥后第15天，單蒽酮650 mg·kg-1劑量組動物IFN-γ的水平顯著下降。IFN-γ可以通過對G1期的阻滯來抑制細胞周期進程，從而抑制肝細胞的增殖，也可以通過激活肝細胞中的信號傳導及轉錄激活因子1通路[18]或增加細胞活性氧的產生和內質網應激[19]來誘導肝細胞凋亡。此外，IFN-γ可以抑制血管內皮生長因子及成纖維細胞生長因子的基因轉錄，從而抑制血管形成[20]。基質金屬蛋白酶是一類水解酶，可降解細胞外基質，破壞阻止腫瘤細胞侵襲的組織學屏障，促進腫瘤血管生長。IFN-γ可以抑制該類酶的表達，從而抑制腫瘤血管的形成[21]。單蒽酮引起的IFN-γ水平下降，可能導致肝細胞過度增殖，刺激腫瘤血管的生成，在病理上有發展為肝癌的可能[22]。

本研究發現何首烏重要單體成分大黃素甲醚具有潛在肝損傷作用，結論與本課題組前期的體外研究[23-24]相符，其作用機制可能與抑制膽紅素代謝酶的活性相關。大黃素甲醚和大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷均為蒽醌類化合物，與大黃素、大黃酸含有相同的蒽醌母核結構[9](見圖3)。目前已有較為充分的研究證實了大黃素和大黃酸的致肝毒性作用[10]，本研究進一步發現大黃素甲醚具有肝毒性作用，提示具有大黃素型蒽醌母核結構的單體成分具有潛在的肝毒性風險。

R1R2R3R4大黃素CH3OHOHH大黃酸COOHOHHH大黃素甲醚CH3OHOCH3H大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷OHGluCH3H

圖3 蒽醌類成分結構圖

本研究的給藥周期較短，受試物造成的肝損傷作用并不明顯。今后將開展更長給藥周期(如28 d連續給藥)的研究，并增加每組動物數，以明確其肝損傷作用特點。同時也可以使用代謝組學的方法，分析3種單體干預后的血漿、尿液等生物樣本，從分子水平探討其致肝損傷的作用機制，為臨床上何首烏的增效減毒提供依據[25]。除傳統的血清生化指標檢測外，本研究亦分析細胞因子水平來評價受試物的肝損傷作用。給藥后第2天，大黃素甲醚給藥組動物IL-6和TNF-α水平即升高，而血清生化檢測結果卻未見肝損傷的發生。大黃素甲醚中、高劑量組AST、CK和LDH水平降低，單蒽酮中、高劑量組CK和LDH水平降低，結果具有統計學意義，但不具有臨床意義，考慮是由于動物個體差異引起的。可見與血清生化指標檢測相比，細胞因子水平檢測可能更為靈敏，可以及早預測藥物的肝毒性作用。