新疆準東油田石油污染土壤萘雙加氧酶基因的多態性

薄明森　呂杰　李興?！●R媛

摘要：為了分析新疆準東油田石油污染土壤中萘雙加氧酶功能基因的多態性，采用無機鹽培養基，以萘為唯一的碳源物質，對準東油田石油污染土壤中的萘降解菌進行液體富集培養，用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，簡稱HPLC）對降解產物進行檢測，同時采用萘雙加氧酶基因通用引物對萘雙加氧酶基因片段進行擴增、測序及分析。高效液相色譜檢測結果顯示，萘被降解成小分子產物，證明液體培養基均富集培養獲得了萘降解菌群。從準東油田共分離得到了49條萘雙加氧酶基因片段，共編碼35條氨基酸序列，GenBank登錄號為KY304781～KY304829。獲得的萘雙加氧酶基因系統發育樹結果顯示，研究獲得的萘雙加氧酶基因分為4個類群。通過高效液相色譜分析及萘雙加氧酶基因的分子檢測，證明準東油田石油污染土壤中含有萘降解菌株，這些萘降解菌株是可以通過液體富集培養獲得的，并且可以通過固體平板獲得降解萘的單菌株。

關鍵詞：萘降解菌;高效液相色譜;萘雙加氧酶基因;克隆文庫

中圖分類號： S151.9+5;S182;X53文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）09-0110-05

芳香族烴類化合物是煤炭、石油等化石燃料的天然組成成分，植物體內含有多種酚類產物，它們不完全燃燒亦可產生芳香烴類化合物。另外，在應對石油短缺問題時，“煤變油”過程中會產生大量結構復雜的芳香烴化合物[1]。極低含量的多環芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，簡稱PAHs）便會對人體造成嚴重危害，是芳香烴化合物中對環境危害最大的一類[2]。PAHs家族包括150多種成員，其中16種被美國環境保護署列為優先考慮的污染物[3]。原油中含有2%～4%的芳香烴，1～5個不等的縮合芳烴[4]，因此，從石油開采區原油污染土壤中可以檢測到高含量的PAHs[5]。該類物質化學結構穩定，難溶于水，在自然環境中很難降解，因而如何消除此類有機污染物，在很長時間內一直困擾著人們。微生物降解被認為是去除PAHs的有效手段，隨著微生物降解菌中雙加氧酶的分離及研究的深入，這一難題正被安全有效地解決[6]。

雙加氧酶基因是芳烴開環降解的第1步，是關鍵酶及限速酶基因。將自然界中的雙加氧酶基因按照α亞基序列信息的聚類分析，可以分為4類：甲苯/聯苯雙加氧酶，萘或多環芳烴雙加氧酶，苯甲酸雙加氧酶，鄰苯二甲酸雙加氧酶。因為多環芳烴雙加氧酶具有其獨特的特征，所以能夠利用芳香烴雙加氧酶α亞基的保守域設計通用引物，用于研究環境中PAHs降解的功能菌群，是行之有效的手段[7-10]。

研究微生物降解PAHs的途徑以及對降解過程中涉及的酶的研究可以為了解微生物對PAHs的轉化能力及代謝方式提供基礎，是將微生物降解應用于污染修復的前提。雙加氧酶基因作用于多環芳烴氧化開環的初始步驟，其多態性及含量決定了土壤的自我修復能力。對于萘雙加氧酶而言，因其活性中心具有相對較小的結構上的保守性，其底物范圍相對比較廣泛[1]，因此，萘雙加氧酶的基因也常被作為原油污染土壤中微生物菌群降解多環芳烴的指標物進行分子檢測[5]。萘雙加氧酶的催化能力差異較大，因此需要對萘雙加氧酶基因資源進行多態性研究，并以此為指導依據，篩選高效降解菌進行污染物的原位修復仍是未來工作的熱點[11]。

本研究采集新疆準東油田原油污染不同年限的沙質土壤，用以分析不同年限原油污染土壤中nah基因的多態性變化，同時以萘為唯一碳源，液體富集培養萘降解菌群，對可培養萘降解菌群中nah基因的多態性進行研究。通過對準東油田石油污染土壤中非培養、可培養萘降解菌群雙加氧酶基因多態性的研究，揭示其原位基因的組成特征，并通過對可培養萘降解菌群雙加氧酶基因的分析，研究降解菌群的培養規律。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 準東油田采油區位于新疆準噶爾盆地東部，地理位置為88°40′～89°22′E，43°40′～44°20′N。試驗采集準東油田同一個采油區3個不同石油污染年限的土壤，土壤樣本編號為ZD1、ZD2、ZD3。于2015年6月采集樣本，采集樣本時與采油區工作人員了解具體情況，ZD1為廢棄單罐井，石油污染時間為5年以上;ZD2為閘閥井，污染時間為1年（持續污染）;ZD3位于采油井邊，污染時間為3年。采樣時去除表面土壤，采集深度為2～20 cm，每個樣點采集5份土樣。將采集的土樣裝入無菌密封聚丙烯袋中，在低溫下運送至實驗室，于4 ℃保存備用。

1.1.2 試驗試劑 PowerSoilTM DNA Isolation Kit土壤基因組DNA抽提試劑盒，購自MO BIO公司;細菌基因組DNA提取試劑盒，購自生工生物工程（上海）股份有限公司;LA Taq DNA聚合酶和DNA marker，購自大連TaKaRa公司;DNA凝膠回收試劑盒，購自杭州Axygen公司;pCR2.1-T vector，購自美國Invitrogen公司;DH5α大腸桿菌感受態細胞，購自北京全式金生物技術有限公司;Hha Ⅰ、Rsa Ⅰ、Hinf Ⅰ，購自美國NEB公司;其余試劑均為國產分析純。

1.1.3 試驗儀器 PCR儀（TC-412），購自TECHNE公司;凝膠成像儀，購自SYNGENE公司;離心機（SIGMA 3-18K），購自Sartorius AG公司;瓊脂糖水平電泳儀（DYCP-31DN），購自北京六一生物科技有限公司。

1.1.4 培養基 液體富集培養基為無機鹽基礎培養基，由大量元素（99 mL）和微量元素（1 mL）2個部分組成。大量元素成分：1.0 g/L （NH4）2SO4，0.8 g/L K2HPO4，0.2 g/L KH2PO4，0.2 g/L MgSO4·7H2O，0.1 g/L CaCl2·2H2O，0.005 g/L FeSO4·7H2O。

微量元素成分：0.039 9 g/L MnSO4·H2O，0.042 8 g/L ZnSO4·H2O，0.034 7 g/L （NH4）6Mo7O24·4H2O[12]。pH值為7.0±0.2，于121 ℃滅菌30 min。在固體培養基中添加 1.5% 瓊脂粉。

1.2 方法

1.2.1 液體富集培養萘降解菌群 等量混合5份石油污染土壤，稱取10 g，加入100 mL液體富集培養基中，再加入 0.05 g 萘作為唯一碳源及能源物質，于180 r/min、32 ℃避光培養7 d。培養結束后吸取10 mL富集培養液，離心收集菌體，將無菌培養基在洗脫后加入新的液體培養基中，此過程重復5次。

1.2.2 高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，簡稱HPLC）檢測萘降解產物 高效液相色譜法檢測的樣本為液體培養96 h后的樣本（外源添加的萘肉眼不可見），用15 mL乙酸乙酯萃取，重復3次。將含有降解產物的乙酸乙酯于12 000 r/min離心3 min，棄沉淀，干燥后加 1 mL 甲醇溶液溶解。測試條件：以甲醇和水（體積比為 82 ∶18）為流動相，流動速度為1 mL/min，進樣量為10 μL，檢測波長為 270 nm，采用C18柱，整個過程的溫度為40 ℃[13]。

1.2.3 土壤基因組DNA的提取與萘降解菌基因組DNA的提取 等量混合每個樣點采集的土樣，分別稱取0.4 g土樣，采用PowerSoilTM DNA Isolation Kit土壤基因組DNA抽提試劑盒對土壤基因組DNA進行提取，操作過程按照說明書相關步驟進行。液體富集萘降解菌群采用生工生物工程（上海）股份有限公司生產的細菌基因組DNA提取試劑盒進行提取，提取時離心收集5 mL富集培養菌液中的菌體。3個土壤所對應的樣品編號為ZD1、ZD2、ZD3，液體搖瓶對應的編號為Y。

1.2.4 萘雙加氧酶基因片段的PCR擴增 采用萘雙加氧酶基因（nah基因）的通用引物（NAH-F：5′-CAAAARCACCTGATTYATGG-3′;NAH-R：5′-AYRCGRGSGACTTCTTTCAA-3′），以不同石油污染年限的土壤總DNA和液體富集培養萘降解菌群總DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應條件參照已報道的條件進行[14]。每個樣本平行擴增3個重復，擴增結束后，電泳檢測。

1.2.5 萘雙加氧酶基因克隆文庫的構建與限制性片段長度多態性（restriction fragment length polymorphism，簡稱RFLP）分型篩選陽性克隆子 為了避免單次擴增的偏向性，混合3個PCR擴增平行樣本產物進行凝膠回收。將回收產物與 pUC18-T 載體連接，轉化大腸桿菌（Escherichia coli） DH5α感受態細胞，每個樣本隨機挑取96個白斑，從而構建準東油田不同年限石油污染土壤以及液體富集培養萘降解菌群中萘雙加氧酶基因的克隆文庫。

用堿裂解法提取克隆文庫質粒DNA，用M13-F、M13-R通用引物對進行載體PCR擴增，反應條件：94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s，51 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環;72 ℃ 5 min。對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，對陽性克隆子進行篩選，之后將陽性克隆PCR產物用限制性內切酶HhaⅠ、RsaⅠ、Hinf Ⅰ進行3輪酶切，酶切產物用2.5%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，將不同RFLP條帶類型對應的克隆子送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，將測序與比對正確的序列信息提交至GenBank數據庫。

1.2.6 系統發育分析 將測序獲得的萘雙加氧酶基因序列在GenBank中進行BLAST同源性比對，下載相似性最高的萘雙加氧酶基因作為標準序列，用MEGA 7軟件，采用鄰接法進行聚類分析，并構建系統進化樹，并用該軟件對萘雙加氧酶的氨基酸序列進行聚類分析[15]。

2 結果與分析

2.1 萘降解菌群降解產物的檢測結果

由圖1和圖2可以看出，萘標準品的保留時間為 4.591 min，而對萘降解培養液提取物進行檢測時發現，在 7.5 min 時出現1個大的吸收峰，在6.7 min時出現1個小峰。HPLC試驗結果表明，在液體培養基中添加的萘，在96 h后已被降解成2個分子量小于萘的降解產物，證明通過液體培養獲得了準東油田萘降解菌的可培養菌群，而對于2個組分的降解產物，有待進一步研究其結構。

2.2 nah基因片段的PCR擴增結果

以不同石油污染年限的土壤總DNA和液體富集培養萘降解菌群的總DNA為模板，進行PCR擴增。如圖3所示，通過PCR擴增，得到了清晰的特異性條帶，條帶大小為400 bp左右，目標條帶大小與預期擴增的nah基因片段大小相符。

2.3 nah基因片段的RFLP分析結果

對克隆文庫中的陽性克隆子進行PCR篩選，將篩選獲得的陽性克隆子PCR產物用限制性內切酶Hha Ⅰ、Rsa Ⅰ和Hinf Ⅰ進行3輪酶切。原本預期采用2種識別4個堿基的限制性內切酶，但是nah基因的部分PCR條帶不能被Hha Ⅰ、Rsa Ⅰ酶切，因此最終采用2種限制性內切酶。用3種限制性內切酶進行RFLP分析的部分結果如圖4、圖5和圖6所示，進一步分析可知，ZD1共有18個帶型，ZD2有13個帶型，ZD3有13個帶型，Y有12個帶型。

2.4 萘雙加氧酶基因的系統發育分析

將測序結果經過BLAST同源比對，去除錯誤結果，最終獲得的nah基因片段數如下：ZD1有16條，ZD2有11條，ZD3有11條，Y有11條。將序列信息提交至GenBank數據庫，GenBank登錄號為KY304781～KY304829。

將獲得的萘雙加氧酶基因序列在GenBank中進行BLAST相似性比對，將相似性較高的序列作為標準序列，用MEGA 7軟件，采用鄰接法聚類分析構建的系統發育樹。由圖7的系統發育樹可以看出，從準東油田石油污染土壤中獲得的萘雙加氧酶基因可以分為Cluster a（Cluster表示簇）、Cluster b、Cluster c、Cluster d 4個類群，其中Cluster b含有2個不同的小類群，Cluster c含有2個不同的小類群，Cluster d含有3個不同的小類群，每個小類群內的相似性在98%以內。Cluster a、Cluster b和Cluster c兩兩間的相似性均在95.5%以上，其中Cluster d與其他類群的相似性均低于85%。

萘雙加氧酶BLAST同源比對得分最高的序列多來自石油污染土壤中的免培養細菌，僅2條序列來自Pseudomonas（假單胞菌屬）菌株的萘雙加氧酶基因，且這2條序列均存在于Cluster b類群中。此外，比對獲得的來源于免培養細菌nah基因的標準序列，除登錄號為KC878841的序列外，其他標準序列均來自大慶油田石油污染土壤[5]，相似性均高于98%，而搖瓶培養獲得的nah基因與Yang等研究得到的來源于克拉瑪依油田土壤細菌的nah基因序列信息相比，相似性反而均低于97%[16]。

將萘雙加氧酶基因序列翻譯成氨基酸序列，用MEGA 7進行聚類分析，由圖8可以看出，本試驗獲得的萘雙加氧酶α亞基的核酸序列為49條，共編碼35條氨基酸序列，與核酸序列聚類結果相同，共分為4個類群，其中Cluster b占整個文庫的70%，Cluster a占整個文庫的22%，為最大的2個類群。從聚類結果可以看出，來自3個不同石油污染年限土壤中的nah基因并沒有很好地聚類，但是從搖瓶培養獲得的nah基因卻聚類成獨自的類群。

3 結論

新疆地區的石油儲量豐富，但是在幾十年的開采過程中，難免會有原油污染物隨著開采加工過程進入土壤中。準東油田采油區大部與古爾班通古特沙漠重合，其土壤微生態環境脆弱，原油滲漏極易破壞微生物菌群結構。原油滲漏后所含的烴類能給微生物提供足夠的碳源，因此沙質土壤中的原核微生物多樣性往往大于背景土壤，認為有機污染物降解主要由原核微生物完成[17]。目前未見針對新疆準東油田開展的原油污染土壤中芳香烴降解酶基因多態性以及石油污染土壤中不同污染物降解菌株分離的報道。

萘雙加氧酶的底物范圍相對比較廣泛，因此萘雙加氧酶基因也常被作為原油污染土壤中微生物菌群降解多環芳烴的指標物進行分子檢測。本研究選擇萘作為限制性培養因子，液體培養萘降解菌群，通過HPLC檢測證明，通過試驗富集培養獲得了萘降解菌群。如果采用該菌群進行污染物的原位修復，會極大地避免采用外來菌株受到土著微生物的競爭捕食作用。此外本研究針對新疆準東油田原油污染土壤中來源的非培養和可培養萘降解菌的功能基因進行多態性研究。結果表明，從3個不同年限石油污染土壤內獲得的nah基因并沒有很好地聚類，但是從搖瓶中獲得的nah基因卻聚類形成獨自的類群，證明萘降解菌群結構與環境中的營養物質成分相關，但是與萘含量并不相關。搖瓶獲得的萘降解菌群的nah基因并未在環境樣本中獲得，說明該菌群在土壤中的含量極低。

通過對準東油田石油污染土壤中非培養和可培養萘降解菌群雙加氧酶基因的多態性研究，揭示其原位功能基因的結構特征，并通過對可培養萘降解菌群雙加氧酶的基因分析，研究降解菌群的培養規律，可以為進一步從準東油田石油污染土壤中獲得萘降解單菌株及其他稠環芳香烴降解菌株提供借鑒。

參考文獻：

[1]章 儉，夏春谷. 芳香烴雙加氧酶的結構與功能研究[J]. 化學進展，2004，16（1）：116-122.

[2]Ravelet C，Grosset C，Montuelle B，et al. Liquid chromatography study of pyrene degradation by two micromycetes in a freshwater sediment[J]. Chemosphere，2001，44（7）：1541-1546.

[3]羅洪君，王緒遠，趙 騫，等. 石油污染土壤生物修復技術的研究進展[J]. 四川環境，2007，26（3）：104-109.

[4]Liang Y T，Zhang X，Wang J，et al. Spatial variations of hydrocarbon contamination and soil properties in oil exploring fields across China[J]. Journal of Hazardous Materials，2012，241（4）：371-378.

[5]Yang Y Y，Wang J，Liao J Q，et al. Distribution of naphthalene dioxygenase genes in crude oil-contaminated soils[J]. Microbial Ecology，2014，68（4）：785-793.

[6]宋興良，王江濤，張 哲. 多環芳烴蒽高效降解菌的篩選及其降解中間產物分析[J]. 海洋環境科學，2010，29（6）：815-818.

[7]Gibson D T，Parales R E. Aromatic hydrocarbon dioxygenases in environmental biotechnology[J]. Current Opinion in Biotechnology，2000，11（3）：236-243.

[8]Abu-Omar M M，Loaiza A，Hontzeas N. Reaction mechanisms of mononuclear non-heme iron oxygenases[J]. Chemical Reviews，2005，105（6）：2227-2252.

[9]Visser S P，Kumar D. Iron-containing enzymes versatile catalysts of hydroxylation reactions in nature[M]. London：Royal Society of Chemistry，2011：42-63.

[10]Iwai S，Johnson T A，Chai B L，et al. Comparison of the specificities and efficacies of primers for aromatic dioxygenase gene analysis of environmental samples[J]. Applied and Environmental Microbiology，2011，77（11）：3551-3557.

[11]王 濤，藍 慧，田 云，等. 多環芳烴的微生物降解機制研究進展[J]. 化學與生物工程，2016，33（2）：8-14.

[12]Hesham A，Wang Z Y，Zhang Y，et al. Isolationand identification of a yeast strain capable of degrading four and five ring aromatic hydrocarbons[J]. Annals of Microbiology，2006，56（2）：109-112.

[13]Qi J，Wang B，Li J，et al. Genetic determinants involved in the biodegradation of naphthalene and phenanthrene in Pseudomonas aeruginosa PAO1[J]. Environmental Science and Pollution Research International，2015，22（9）：6743-6755.

[14]Baldwin B R，Nakatsu C H，Nies L. Detection and enumeration of aromatic oxygenase genes by multiplex and real-time PCR[J]. Applied and Environmental Microbiology，2003，69（6）：3350-3358.

[15]Kumar S，Stecher G，Tamura K. MEGA7：molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets[J]. Molecular Biology and Evolution，2016，33（7）：1870-1874.

[16]Yang Y Y，Wang J，Liao J Q，et al. Abundance and diversity of soil petroleum hydrocarbon-degrading microbial communities in oil exploring areas[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2015，99（4）：1935-1946.

[17]譚銀萍，馬 媛，呂 杰. 石油污染對土壤細菌結構特征的影響[J]. 生物技術，2016，26（2）：193-198.