西藏林芝散養藏雞新城疫抗體ELISA檢測分析

陳家露，蔡重振，扎西卓瑪，甘富斌，索朗斯珠，羅潤波*

(1.西藏農牧學院 動物科學學院，西藏 林芝 860000；2.西藏林芝市農業農村局畜牧獸醫總站，西藏 林芝 860000；3.西藏林芝市巴宜區農業農村局，西藏 林芝 860000)

雞新城疫（Newcastle disease,ND），俗稱亞洲雞瘟，是由新城疫病毒（NDV）強毒所引起的雞和多種禽類的高度接觸性傳染病，易感禽類常呈現敗血經過。其傳播速度快、四季皆發、死亡率高，對禽類養殖戶造成嚴重的威脅與損失。20世紀80年代以來，由于疫苗的廣泛使用和各種生物安全措施的不斷提高，我國新城疫的流行得到了一定的控制，但無法做到全面免疫，同時免疫失敗的現象屢有發生[1-2]，導致該病在我國也有流行。藏雞作為高原特有品種，具有普遍散養、活動性強、抵抗力強等特點，雖然未見發病的報道，但仍然是新城疫的易感動物。為了解西藏林芝市散養藏雞群新城疫的流行情況，課題組于2018年10月在西藏林芝市巴宜區藏雞散養戶中隨機采集藏雞血液并提取血清，定性檢測新城疫抗體。以期對藏雞新城疫的防控提出合理建議。

1 試驗材料

1.1 儀器與試劑

無菌采血針、真空采血管、離心機（型號HD2-4）購自鴻科科技、高精度加樣槍：0.5～ 10μl、10～ 100μl、200～ 1 000μl高精度加樣排槍：10～100μl均購自德國艾本德股份公司、恒溫培養箱、酶標儀(型號RT-2100C)購自深圳雷杜生命科學股份有限公司、雞新城疫抗體ELISA試劑檢測盒(批號HLE60097)由上海哈靈生物技術有限公司生產。

1.2 血樣的采集

在西藏林芝市周邊散養藏雞戶中隨機抽樣，采取翅下靜脈血液，每羽3～4 ml，冷藏并于2 h內送回實驗室[3]。

1.3 血樣的處理

將所取全血在有血清析出時置于離心機中以3 000r/min，離心10 min，取上清液置于1.5 ml無菌EP管并進行編號，放置4℃冰箱備用。

2 試驗方法與判斷

2.1 試驗方法

將冷藏試劑盒取出置于室溫平衡20 min后，在 H9、H10孔中加入陽性對照50μl；H11、H12孔中加入陰性對照50μl；其余孔中依次加入待檢血清，各10μl；再加入樣本稀釋液各40μl。在所有樣本孔與陰、陽性對照孔中加入辣根過氧化酶 (HRP)標記的檢測抗體100μl，用封板膜封住反應孔，置于37℃恒溫培養箱溫育1 h。在吸水紙上拍干廢液后加入洗滌液，靜置1 min后再拍干，如此反復5次洗滌過程。每孔加入底物TMB各50μl，37℃避光溫育15 min；最后加入終止液50μl，15 min測定其OD450nm值。

2.2 結果判斷

在陽性對照孔OD值平均值≥1.00；陰性對照孔OD值平均值≤0.15時判定試驗結果有效。當待檢血清OD值＜臨界OD值(臨界OD值＝陰性對照孔OD值平均值+0.15)時判定為陰性；反之為陽性。

3 試驗結果與討論

本次共計分離得到藏雞血清92份，根據酶標儀顯示陽性對照孔的平均OD值為1.1785(＞1.00)；陰性對照孔的平均OD值為0.0955(＜0.15)；表明本次試驗結果有效。計算得出臨界OD值為0.2455(臨界OD值＝陰性對照孔OD值平均值+0.15)，92份藏雞血清OD值均小于臨界OD值，表明本次所檢測的藏雞血清中均無新城疫抗體陽性。具體試驗結果見表1。

表1 92份藏雞血清新城疫抗體ELISA檢測試驗結果

酶聯免疫吸附試驗檢測新城疫抗體是目前應用最廣泛的一種方法，在ND的檢測中體現了操作簡便、檢測量大、敏感性好的優點[4]。課題組通過ELISA試劑盒的運用，對散養藏雞的新城疫抗體檢測發現92份散養藏雞血清中并未檢測出新城疫抗體，這可能是由于西藏林芝市散養藏雞并未感染新城疫或未接種新城疫疫苗，同時也可能是免疫維持期已過。通過課題組走訪調查西藏林芝市巴宜區藏雞散養戶，發現散養藏雞并未接種新城疫疫苗。表明在此地區散養藏雞中無新城疫的流行。

有學者對西藏林芝市某雞場新城疫抗體檢測發現，圈養雞免疫合格[5]。課題組通過檢測發現散養藏雞中無新城疫的流行。因此建議林市散養藏雞戶，建立嚴格的衛生管理制度，防止外來雞帶入病毒感染本地藏雞，同時防止人員、來訪客、飼養用具等雜物的間接傳播，要嚴格執行衛生消毒管理制度。

散養藏雞新城疫免疫應結合實際制定科學的免疫措施，并根據林芝當地疫病流行情況、飼養類型、母源抗體效價等具體情況來確定免疫時機與次數；一般以6～10日齡首次接種為宜，15天后進行二次免疫[6-7]；同時，要按照要求進行監測，建立和完善新城疫監測系統。