改良聯合酶消化法提取成年小鼠原代心臟成纖維細胞

陳洪群，鄭梅，晏乘曦，黃鵬，趙興山

(1民航總醫院，北京100123；2北京積水潭醫院；3首都醫科大學宣武醫院)

隨著現代動物實驗技術的發展，原代細胞的分離提取已經廣泛應用于各個領域的研究[1～4]。成年小鼠的心臟成纖維細胞，在研究心臟纖維化[5～7]、心衰、心臟重構[8～10]等方面應用廣泛。目前大多數實驗采用細胞系作為實驗對象，但細胞系是永生化的細胞，其基因型、生理特性等都已發生變化，不能完全反映細胞真實狀態[11]。國內偶有原代小鼠心臟成纖維細胞的提取方法，但大多是乳鼠。既往提取小鼠心臟成纖維細胞的方法多為聯合酶室溫下消化法[12]或利用提取心肌細胞后剩余殘液培養成纖維細胞。聯合酶室溫下消化法受室內溫度影響較大，在不同季節、不同實驗室難以重復；消化提取時間過長，大量成纖維細胞被消化酶損傷，導致成纖維細胞產量少，難以傳代。利用提取心肌細胞后剩余殘液培養成纖維細胞法提取殘液中混雜內皮細胞等導致成纖維細胞純度低。2017年12月～2018年4月，我們在聯合酶消化法的基礎上改進了消化溫度、提取液儲存方式(改良聯合酶消化法)穩定地提取了成年小鼠原代心臟成纖維細胞。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑 C57BL/6 小鼠，雌雄不限，SPF 級，42～46日齡，體質量15～20 g，購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0011。主要試劑：HG/DMEM、胎牛血清(FBS)、青霉素、鏈霉素均為美國 Gibco公司產品，Ⅱ型膠原酶、胰蛋白酶均為美國Sigma公司產品。HE染色試劑盒為北京索萊寶公司產品，盤狀結構域受體 2(DDR2)一抗(ab203128)、熒光二抗(ab150080)，波形蛋白一抗(ab92547)、熒光二抗(ab150077)為美國Abcam 公司產品。

1.2 試劑準備 液體配制：10% FBS 100 mL，分別裝在2個50 mL離心管里(依次加入500 μL雙抗，5 mL FBS，44.5 mL DMEM)；消化酶：40 mg 胰酶、24 mg Ⅱ 型膠原酶溶于40 mL PBS中(在50 mL離心管中配制)，顛倒混勻之后，用50 mL注射器+一次性濾器過濾到新的50 mL離心管中，封口膜封口放入37 ℃水浴待用。將配好的10% FBS加入15 mL離心管中(每管加6 mL，共加10管)，加完封口膜封口放入冰盒待用。將冰冷的PBS加入100 mL的培養皿中(每皿加 20 mL，三個皿都加)，放在操作臺待用。

1.3 心臟的獲取 6只C57 BL/6成年小鼠拉頸處死后，放在含75%酒精的容器中浸泡5 s取出，固定在泡沫板上，固定四肢，依次剪開皮膚、剪開胸骨劍突，暴露心臟，用另一個鑷子在主動脈根部薅下心臟，立即放入含有冰冷PBS的100 mL皿里。清洗心臟，洗凈血污，修剪結締組織和心房，保留心室(在3個皿中洗凈血污)。用鑷子將心室塊加入50 mL離心管中，用彎頭剪剪碎，大約 1 mm3方塊。

1.4 改良聯合酶消化法提取心臟成纖維細胞 消化：向含有心室碎塊的50 mL離心管中加入預熱好的消化酶 5 mL，封口后，置于37 ℃溫育，輕搖6 min，靜置10 s，用3 nL塑料吸管吸取上清，加到含有10% FBS的15 mL離心管中，輕輕顛倒混勻幾次，擰緊蓋子，封口，放入冰盒。剩余心室碎塊，繼續加入5 mL 消化液，重復上述消化步驟，直至將組織消化(大約消化 10 次)。所得細胞懸液拿進操作臺，用70 μm細胞篩過濾到50 mL離心管中，每個50 mL離心管中裝30 mL。 離心：將裝有細胞懸液的50 mL離心管配平后，1 200 r/min離心7 min。取出后，棄掉上清，用10% FBS輕輕吹打混勻細胞，接種到T25培養瓶中,放入溫箱培養。差速貼壁：2 h后，取出T25培養瓶，吸出上清棄掉，用3 mL移液管加5 mL 10% FBS至瓶底，然后輕輕放平培養瓶，做好標記，放入溫箱。隔天換液一次。傳代：3 d后，待細胞長至80%～90%時，使用0.25%胰酶(含EDTA)消化細胞：將分裝的胰酶放入37 ℃水浴箱待用，取出長滿細胞的T25培養瓶，吸棄培養基，加入2 mL胰酶，室溫下消化3～5 min，邊消化邊振蕩，顯微鏡下觀察細胞開始脫落時，加入培養基終止消化，反復吹打后將細胞懸液吸入50 mL離心管，以1 200 r/min 離心5 min，棄上清，使用培養基混勻細胞沉淀，種植于新的T25培養瓶，繼續培養。

1.5 心臟成纖維細胞鑒定 ①蘇木精-伊紅染色:爬片準備：培養的心臟成纖維細胞按 1×105/孔接種于6孔板(孔中提前放入玻片)，待細胞生長至90%時，吸棄培養基，1×PBS洗3次，每次5 min。細胞固定：往爬片上加入4%多聚甲醛2 mL，蓋過爬片即可，固定20 min，之后1×PBS洗3次，每次5 min染核：加入蘇木素溶液2 mL，室溫下染核8 min。吸棄蘇木素溶液，自來水洗滌爬片，注意輕柔，避免大量細胞被洗掉。洗完之后不需分化。染胞質：加入伊紅溶液，室溫下染色1 min。吸棄伊紅溶液，自來水洗滌爬片。封片：爬片室溫下自然晾干后，中性樹膠封片。此步驟必須避免氣泡。 鏡下觀察拍照。②免疫熒光法:6孔板里的細胞長到90%,吸棄培養基，PBS輕輕洗2次，每次1 min。每孔加入4%多聚甲醛2 mL，室溫下放置30 min(固定細胞)，之后吸棄多聚甲醛后用PBS洗3次，每次5 min。每孔加入0.3% Triton-X100 2 mL，室溫下30 min(細胞打孔)，之后PBS洗3次，每次5 min。5% BSA封閉液，每孔1 mL，室溫下封閉30 min，吸棄BSA，用濾紙吸掉多余BSA。滴加200 μL 1∶00稀釋的一抗，錫箔紙嚴密包裹，4 ℃過夜。之后PBS洗3次，每次5 min。滴加200 μL 1∶100 的熒光標記二抗，37 ℃避光溫育20 min。之后吸棄二抗，取出玻片，室溫盡快晾干后用含 DAPI 的封片劑封片：此步驟不可有氣泡，熒光顯微鏡下觀察。

2 結果

顯微鏡下可見大量細胞貼壁，細胞呈橢圓形或圓形，立體感較強(見圖1)，24 h后細胞伸展呈梭形，貼壁生長，排列緊密，細胞之間連接緊密，較扁平(見圖2)。3 d后細胞平鋪長滿，呈梭形，細胞間排列緊密(見圖3)。

經蘇木精-伊紅染色染色后，顯微鏡下觀察，見細胞呈梭形，單層排列，細胞質紅染，細胞核藍染。免疫熒光鑒定可見細胞陽性表達波形蛋白(圖4)和DDR2(圖5)，陽性表達率可達90%以上。

圖1 顯微鏡下原代心臟成纖維細胞形態(100×)

圖2 顯微鏡下首次傳代24 h后心臟成纖維細胞形態(100×)

圖3 顯微鏡下首次傳代3 d后心臟成纖維細胞形態(100×)

圖4 波形蛋白陽性心臟成纖維細胞(免疫熒光法,400×)

圖5 DDR2陽性心臟成纖維細胞(免疫熒光法,400×)

3 討論

心肌成纖維細胞是心臟非心肌細胞的主要組成部分，占正常心臟組織細胞總數的 60%～70%，其功能主要是合成細胞外基質蛋白，是合成心肌膠原的主要細胞。正常情況下，心肌成纖維細胞數量較少且基本處于非活化狀態;在缺血、壓力負荷、炎癥等多種病理性條件的刺激下，成纖維細胞活化，發生增殖、遷移、轉化、合成細胞外基質等功能改變。心肌成纖維細胞的活化是心肌纖維化的關鍵步驟,其在心室重構的發展中起著非常重要的作用[13]。心肌成纖維細胞在轉化生長因子β(TGF-β)刺激下，增殖分化為肌纖維細胞后，遷移、增殖及分化膠原的能力增強，同時肌纖維細胞特征性標物α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)表達增加。激活的肌纖維細胞可產生Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維，增加細胞外基質的聚集及炎癥介質的產生，造成心室重構[9,10]。

聯合酶消化法是利用胰酶和Ⅱ型膠原酶對原代組織進行消化，獲取相應原代細胞的方法，此方法廣泛應用于犬心房肌細胞[14]、新生大鼠心肌細胞[15]、成年小鼠心臟成纖維細胞[12]等的提取。對于成年小鼠原代心臟成纖維細胞，既往多采用室溫下消化，消化時間多由實驗者根據實時消化情況決定，難以在多個實驗室以及不同室溫情況下重復。關于既往報道的37 ℃水浴消化30～40 min的消化條件，本實驗組多次重復證實，此消化方法會導致大量心臟成纖維細胞破壞，無法貼壁生長或傳代，于是改良了聯合酶消化法，于37 ℃恒溫箱內進行6 min消化，并將細胞的消化液進行冰上儲存。

正常情況下心臟成纖維細胞呈梭形，HE染色可清晰顯示其形態，并能觀察細胞質及細胞核。在細胞形態學鑒定的前提下，進一步進行免疫熒光鑒定。波形蛋白是一種成纖維細胞標記物，是間質細胞中最主要的中間纖維，它存在于中胚層起源的細胞中[16]，并與微管、微絲共同形成了一個細胞支架網絡而維持細胞完整性。實驗表明，可根據抗波形蛋白表達陽性來鑒定心臟成纖維細胞。心臟成纖維細胞的一種更為特異性的標記物為DDR2[17]，是膠原特異性受體酪氨酸激酶家族的典型代表，這些受體介導細胞的生長、移行、結構形成及分化等功能，在心肌細胞及平滑肌細胞中無表達。本研究證實，改良聯合酶消化法得到的細胞呈梭形，單層排列，細胞質紅染，細胞核藍染；免疫熒光鑒定可見波形蛋白，DDR陽性表達率可達90%以上，提示此法可成功地提取心臟成纖維細胞，且細胞純度很高。

綜上所述，改良聯合酶消化法可以穩定地提取成年小鼠原代心臟成纖維細胞， 此方法可推廣應用于原代心臟細胞纖維化、心衰、心臟重構等方面的研究。聯合酶消化本身對成纖維細胞有一定損害，有可能改變細胞特性，因此，更高效、無害的提取方法有待于研究者進一步探索。