原發(fā)性骨性關節(jié)炎膝關節(jié)軟骨細胞差異表達circRNA、miRNA篩選和生物學功能及其相互作用分析

王瑩，郭雄，王民，楊益民，任志偉，尹思

(1西安交通大學第一附屬醫(yī)院，西安710061；2西安交通大學醫(yī)學部公共衛(wèi)生學院)

原發(fā)性骨性關節(jié)炎(OA)是一種以軟骨退變和繼發(fā)性軟骨下骨增厚、骨贅形成和滑膜炎為特征的關節(jié)疾病，是全球范圍普遍存在的肌肉骨骼系統疾病，其病因復雜,涉及到遺傳生物學和生物力學，發(fā)病機制至今尚不明確。公認的危險因素包括既往關節(jié)損傷、年齡、性別、遺傳易感因素和機械應力因素[1]。越來越多的研究證實，miRNA作用于OA軟骨細胞的靶基因，調節(jié)其表達過程，對軟骨細胞代謝、增殖、分化的信號通路及細胞外基質合成與代謝產生影響。目前公開發(fā)表的與OA相關circRNA主要在ECM降解、軟骨細胞增殖、細胞凋亡和炎癥中發(fā)揮潛在作用，2018年Li等[2]探討了環(huán)狀RNA在骨關節(jié)炎中的潛在作用，指出 circRNAs-miRNAs-mRNAs軸在OA的發(fā)病機制中起重要作用。2018年9月～2019年3月，本研究應用生物信息學方法篩選OA膝關節(jié)軟骨細胞差異表達的circRNA、miRNA，并進行功能及代謝通路分析，同時應用incromap軟件對差異表達的circRNA、miRNA進行了相互作用分析，為探索OA的發(fā)病機制提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇西安交通大學第一附屬醫(yī)院骨科住院OA患者5例，符合Western Ontario大學和McMaster大學用OA指數(WOMAC)進行OA診斷的診斷標準，排除任何有其他骨骼或關節(jié)疾病史的患者?；颊呔邮芟リP節(jié)置換術，術中取OA患者膝關節(jié)股骨髁軟骨。另選5例肢體毀損無法保肢而接受截肢的患者作為對照，術中取膝關節(jié)股骨髁軟骨。取材組織離體后立即用生理鹽水沖洗，修成直徑3～5 mm顆粒狀，標記好每個組織標本類型及編號后置于無菌生理鹽水或PBS中，12 h內做細胞培養(yǎng)。

1.2 OA膝關節(jié)軟骨細胞差異表達circRNA篩選 根據制造商產品使用說明用TRIzol法(Invitrogen, Gaithersburg, MD, 美國)提取5例OA及正常對照膝關節(jié)軟骨細胞中的總RNA，采用 NucleoSpin RNA clean-up 試劑盒(MACHEREY-NAGEL,德國)對總RNA進行純化；使用NanoDrop ND-1000分光光度計進行總RNA定量，用甲醛變性膠電泳檢測其完整性；RNA總量≥1 μg；所有軟骨組織樣品總RNA的A260/A280值均在1.82～2.05，樣品總RNA可見清晰的28 s和18 s條帶，且A260/280≥1.80；經甲醛變性膠電泳檢測，RNA樣品電泳條帶清晰，28 s∶18 s rRNA條帶亮度≥2∶1，提示樣品總量、純度及完整性符合芯片表達譜實驗要求。使用Nucleospin Extract Ⅱ(MN 公司，Cat. No. 740609.250)試劑盒，按照生產商操作指導步驟對每個樣本的總RNA采用隨機引物擴增、然后反轉錄為熒光標記的cRNA；標記后的樣品按照CapitalBio表達譜芯片配套提供的雜交標準流程和配套試劑盒組裝好雜交倉，放在Agilent公司雜交爐中過夜雜交(16 h，20 r/min)，然后用洗脫試劑盒洗片；最后進行芯片掃描：circRNA 芯片(CapitalBio Technology Human CircRNA Array v2, CapitalBio Corporation, 北京)包括170 340 個人類circRNA探針，圖像采集、數據分析等由北京博奧晶典生物技術有限公司完成。CapitalBio Technology Human CircRNA Array v2雜交掃描后的 tiff 格式圖片數據應用Feature Extraction(v10.7) 軟件進行預處理分析，將原始數據文件(.txt)導入Agilent GegeSpring軟件，進行每個樣品的數據歸一化和質量控制分析。用Cluster3.0軟件進行Cluster分析及圖形化展示，進行不同組間的差異比較。以差異倍數和P值為篩選條件，篩選不同組間差異表達的circRNA，差異倍數>2及P<0.05為差異有統計學意義。

1.3 OA膝關節(jié)軟骨細胞差異表達miRNA篩選 將OA和正常對照膝關節(jié)軟骨細胞的miRNA原始數據(下載自ArrayExpress，獲取號為：E-MTAB-3514)進行對數轉換后使用Quantile方法進行標準化。使用經驗貝葉斯模型(eBayes),以P<0.05，差異倍數≥2或≤0.5為篩選條件，進行OA和正常對照的miRNA差異分析。應用miRror工具進行差異表達miRNA的靶基因預測，使用KOBAS軟件對靶基因進行GO及KEGG富集分析。

1.4 OA膝關節(jié)軟骨細胞差異表達circRNA及miRNA相互作用分析 應用miRanda 軟件對差異表達的miRNA 進行miRNA-circRNA相互作用預測分析。按照P<0.05和差異倍數≥2，挑選差異倍數從大到小排列的前10個circRNA和miRNA進行相互作用分析，得到circRNA-miRNA相互作用網絡。

2 結果

2.1 OA和正常對照膝關節(jié)軟骨細胞差異表達的circRNA及功能、代謝通路 共篩選出1 380個表達差異的circRNA，與正常對照膝關節(jié)軟骨細胞比較，OA膝關節(jié)軟骨細胞上調表達的circRNA 215個，其中差異倍數5倍以上的有18個；下調表達CircRNA 1 165個，其中差異倍數5倍以上的有45個；大于60個miRNA結合位點的circRNA共有383個，其中上調表達10個，下調表達373個。符合上述條件的上調及下調表達的前10位circRNA見表1。分子功能層面，差異表達的circRNA主要影響GTP酶激活劑活性(GO:0005096)、腺苷核糖核苷酸結合(GO:0032559)、鈣通道調節(jié)劑活性(GO:0005246)；細胞組成層面，主要與細胞外基質成分(GO:0044420)、帶狀膠原纖維(GO:0098643)、纖維狀膠原蛋白三聚體(GO:0005583)；生物學過程層面，主要影響細胞成分形態(tài)發(fā)生(GO:0032989)、軟骨細胞發(fā)育(GO:0002063)和肢體發(fā)育(GO:0060173)。差異表達的circRNA經KEGG 通路分析，共得出1 127條通路，按富集程度最有意義的通路與糖原生物合成(來自Biocyc數據庫)、補體和凝血級聯(來自KEGG路徑數據庫)、PDGF信號途徑(來自Panther數據庫)、膠原纖維組裝和其他多聚體結構(來自Reactome數據庫)有關。

表1 符合納入條件的上調及下調表達的前10位circRNA

2.2 OA和正常對照膝關節(jié)軟骨細胞差異表達的miRNA及功能、代謝通路 篩選出差異表達miRNA 24個，與正常對照比較，OA膝關節(jié)軟骨細胞上調表達及下調表達的miRNA各12個。生物學過程層面，OA膝關節(jié)軟骨細胞差異表達的miRNA主要影響含核堿基的化合物生物合成過程(GO:0034654)、細胞質翻譯終止(GO:0002184)、神經生長(GO:0022008)和細胞發(fā)育(GO:0048468)；細胞組成層面，差異表達的miRNA主要與細胞內部分(GO:0044424)、翻譯釋放因子復合體(GO:0018444)、膜結合的細胞器(GO:0043227)、核轉錄抑制因子復合物(GO:0090568)相關；在生物學過程層面，差異表達的miRNA主要影響有機環(huán)狀化合物結合(GO:0097159)、核酸結合(GO:0003676)和雜環(huán)化合物結合(GO:1901363)。差異表達的miRNA經KEGG通路分析，共得出470條通路，按富集程度最有意義的通路與蛋白質泛素化(來自Biocyc數據庫)、白細胞跨內皮遷移(來自KEGG路徑數據庫)、泛素蛋白酶體途徑(來自Panther數據庫)、基因表達和蛋白質代謝(來自Reactome數據庫)有關。

2.3 OA膝關節(jié)軟骨細胞差異表達miRNA和circRNA的相互作用 與has-miR-762相關的circRNA有71個、has-miR-18a-3p相關的circRNA有25個、has-miR-136-5p相關的circRNA有5個、has-miR-3131相關的circRNA有17個、has-miR-3189-3p相關的circRNA有29個。

3 討論

2013年國際權威期刊Nature發(fā)表了兩篇有關circRNA生物學功能的論文，揭開了circRNA的神秘面紗，引起國內外學術界的廣泛關注。circRNA最早于20世紀70年代在RNA病毒中發(fā)現，當時被認為是一類由外顯子轉錄本發(fā)生錯誤剪接而形成的低豐度RNA分子，有學者稱之為暗黑RNA。與線性RNA分子相比，circRNA呈現共價閉合環(huán)狀結構，缺乏5’端腺苷帽和3’端多聚腺苷酸尾[3]，不被核酸外切酶RNase降解，所以比線性RNA更穩(wěn)定，具有高度保守性。circRNA分子富含miRNA應答元件，可作為競爭性內源RNA與miRNA結合，起到miRNA海綿作用，還可以同時抑制數個不同的miRNA，發(fā)揮網絡調控作用，可以通過改變miRNA應答元件的種類、數量和比例使circRNA達到不同的調節(jié)效果[4]。Zhou等[5]建立了IL-1β誘導的小鼠OA模型，應用下一代測序法篩選小鼠關節(jié)軟骨環(huán)狀RNA譜，并進行GO及KEGG分析預測circRNA的功能，結果表明circRNA在OA的始動和進展中起重要作用。本研究結果證實，OA與正常對照膝關節(jié)軟骨細胞circRNA表達譜存在差異，差異表達基因1 380個，表明circRNA參與OA發(fā)生發(fā)展。我們針對差異表達circRNA進行GO富集分析，結果提示OA膝關節(jié)軟骨細胞差異表達的circRNA主要集中在GTP酶激活劑活性、鈣通道調節(jié)劑活性、細胞外基質成分、軟骨細胞發(fā)育和肢體發(fā)育。KEGG通路分析得出1 127條通路，按富集程度最有意義的途徑與糖原生物合成、補體和凝血級聯、PDGF信號途徑、膠原纖維組裝和其他多聚體結構有關。

越來越多的研究證實，miRNA作用于OA軟骨細胞的靶基因，參與OA的發(fā)生發(fā)展，調節(jié)其表達過程，對軟骨細胞代謝、增殖、分化的信號通路及細胞外基質合成與代謝產生影響。miRNA是一類與同源mRNA相互作用的長度約22個核苷酸的內源性非編碼單鏈小分子RNA[6]，成熟的miRNA來自具有發(fā)卡結構的pre-miRNA，由Dicer 酶進行剪切。miRNA單鏈與AGO蛋白結合成RNA誘導沉默復合體并特異性地結合靶基因mRNA 的3’UTR區(qū)，通過增強降解、抑制翻譯或通過其他機制來改變基因的轉錄后調控，從而下調miRNA的靶基因表達[7]。有前期發(fā)表的文獻[7]指出，miRNA是數百個基因的調節(jié)器，這些基因與軟骨發(fā)育、動態(tài)平衡和OA病理學過程有關;由于其調節(jié)凋亡和活性氧的能力，在OA軟骨細胞異常自噬反應中發(fā)揮重要作用[8]。Wu等[8]對許多研究結果進行綜述，發(fā)現超過25個miRNA與軟骨發(fā)育和OA有關，特別是與調節(jié)軟骨細胞肥大和蛋白水解酶合成相關。另外，部分OA軟骨信號轉導通路也受miRNA調節(jié)，例如TGF-β、骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族、基質金屬蛋白酶(MMPs)、誘導型硝酸合酶(iNOS)IL-1和TNF-α通路[9]。Cong等[10]在回顧已發(fā)表的文獻時，發(fā)現許多miRNA在OA中有差異表達，其中上調的miRNA主要針對發(fā)生在細胞核的生物過程，而下調的miRNA主要針對轉錄過程，表明miRNA在OA的始動及發(fā)展中起重要作用。具體來講，miR-9、miR-27、miR-34a、miR-140、miR-146a、miR-558和miR-602在OA中異常表達，在其病理過程中起重要作用。2009年，Jones等比較了接受膝關節(jié)置換的關節(jié)軟骨和先前沒有關節(jié)痛病史的供體死亡后捐獻的軟骨，用人類miRNA表達譜分析鑒定出OA患者軟骨中有17個miRNA和骨骼中的30個miRNA，與正常組織相比差異倍數大于4倍。與正常對照組織比較，miR-9和miR-98在OA軟骨組織中均表達上調，后期的功能研究證實miR-9和miR-98都通過抑制IL-1β介導的TNF-α產生而參與炎癥途徑，而miR-9的過表達也減少了IL-1β誘導的MMP-13蛋白釋放[11]。Miyaki等[12]構建miR-140基因缺失小鼠誘導出OA的蛋白多糖丟失及關節(jié)軟骨纖維化特征樣變，證實miR-140通過靶向ADAMTS-5的基因從而抑制其表達，而ADAMTS-5是被公認重要的導致關節(jié)軟骨基質降解的重要水解酶；而過表達miR-140則表現出抵抗抗原誘導性關節(jié)炎的特征。本研究應用OA和正常對照軟骨的miRNA原始數據進行miRNA表達譜分析，得到差異表達基因24個，表明miRNA與OA的發(fā)生發(fā)展相關。本研究中，差異表達的miRNA的GO富集分析主要集中在含核堿基的化合物生物合成過程、神經生長和細胞發(fā)育。差異表達的miRNA經KEGG通路分析得出470條通路，按富集程度最有意義的途徑與蛋白質泛素化、白細胞跨內皮遷移、泛素蛋白酶體途徑、基因表達和蛋白質代謝有關。

circRNA作為miRNA海綿是比較成熟的理論，通過競爭性結合miRNA從而調控下游靶基因的翻譯，二者密切相關。本研究對OA軟骨進行miRNA及circRNA高通量分析，二者富集到的共同通路有Cell adhesion molecules pathway和Circadian entrainment pathway。Dudek等[13]總結了Circadian entrainment pathway在肌肉、骨骼及軟骨中的作用，特別關注組織生理學中晝夜節(jié)律的證據,該領域的研究具有很大的潛力，可以幫助我們理解晝夜節(jié)律如何控制肌肉骨骼組織的正常及病理狀態(tài)，對與年齡相關疾病具有重要意義，并且對運動醫(yī)學有潛移默化的影響。Schett等[14]在前瞻性Bruneck隊列研究中評估嚴重髖或膝關節(jié)OA的人口統計學特征、生活方式以及可溶性血管細胞黏附分子1(VCAM-1)的水平，得出VCAM-1可以作為嚴重OA具有髖膝關節(jié)置換風險強有力且獨立的預測因子之結論。在一項基于手OA的患病率和嚴重程度相關人群的橫斷面研究[15]中，發(fā)現可溶性VCAM-1的血清水平與手OA的受累關節(jié)數量正相關。Karatay等[16]在關于OA治療的臨床報道中指出，關節(jié)腔注射透明質酸(HA)后ICAM-1和VCAM-1水平降低可以解釋HA治療膝關節(jié)OA的抗炎作用。

我們進而對人類OA膝關節(jié)軟骨細胞circRNA及miRNA表達譜進行了整合分析，應用miRanda軟件進行circRNA和miRNA相互作用分析，得到circRNA-miRNA相互作用網絡。其中,has-miR-762、has-miR-18a-3p、has-miR-136-5p與 circRNA關系最為密切，結合的circRNA也最多。張申華等[17]通過qPCR分析40位卵巢癌患者癌組織中miR-762和menin蛋白的表達情況，并通過蛋白免疫印跡實驗檢測miR-762對menin蛋白及Wnt通路中增殖相關蛋白的調節(jié)作用，證實miR-762在人卵巢癌組織中呈高表達，并可能通過抑制menin蛋白及激活Wnt通路從而促進卵巢癌的進展。體外實驗研究表明，miR-136-5p的過表達促進了脊髓損傷大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-α、IKKβ和NF-κB的生成，抑制了A20蛋白的表達，炎性細胞向大鼠脊髓的浸潤增加，導致脊髓損傷明顯加重,沉默miR-136-5p可顯著改善炎癥細胞浸潤和脊髓損傷。因此，miR-136-5p可能成為治療脊髓損傷的新靶點。目前尚無對miR-18a-3p的報道。

差異表達的miRNA與軟骨細胞自噬功能障礙、氧化應激和信號通路有關，這與OA的發(fā)病機制相關。circRNA是否也參與OA的病理生理過程被提上研究日程，circRNAs-miRNAs-mRNAs軸在OA的發(fā)病機制中起重要作用[2]，circRNA翻譯而來的蛋白質在生理條件下可能相對無功能，但是細胞內或細胞外應激可能促進激活非依賴性翻譯模式，因此circRNA編碼的蛋白可能在病理條件下起關鍵作用。本研究結果與文獻報道一致。目前將miRNA或者circRNA作為OA 治療靶點的研究還局限于動物實驗模型階段，應用于臨床治療尚未取得突破性進展，真正將這類小分子應用于OA的臨床治療依然任重而道遠。

綜上所述，OA膝關節(jié)軟骨細胞中差異表達的circRNA有1 380個，其中215個上調表達，1 165個下調表達，差異表達的circRNA主要影響GTP酶激活劑活性、腺苷核糖核苷酸結合、鈣通道調節(jié)劑活性等分子功能，細胞外基質成分、帶狀膠原纖維、纖維狀膠原蛋白三聚體等細胞組成，細胞成分形態(tài)發(fā)生、軟骨細胞發(fā)育和肢體發(fā)育等生物學過程，主要與糖原生物合成、補體和凝血級聯、PDGF信號途徑、膠原纖維組裝和其他多聚體結構等相關代謝通路有關。與正常軟骨細胞比較，OA膝關節(jié)軟骨細胞中共篩選出差異表達miRNA 24個，其中上調表達及下調表達的miRNA各12個，差異表達的miRNA主要參與含核堿基的化合物生物合成過程、細胞質翻譯終止、神經生長和細胞發(fā)育，影響細胞內部分、翻譯釋放因子復合體、膜結合的細胞器、核轉錄抑制因子復合物，有機環(huán)狀化合物結合、核酸結合和雜環(huán)化合物結合，與蛋白質泛素化、白細胞跨內皮遷移、泛素蛋白酶體途徑、基因表達和蛋白質代謝有關。circRNA和miRNA共同通路有Cell adhesion molecules pathway和Circadian entrainment pathway；circRNA-miRNA相互作用網絡中，has-miR-762、has-miR-18a-3p、has-miR-136-5p與circRNA關系最為密切。本研究中我們應用的CapitalBio Technology Human CircRNA Array v2在每張芯片上設計了四個陣列，每個陣列包含約170 340個人類circRNA探針。即使是如此龐大的探針數量，因為芯片版本不斷更新，不除外新的circRNA此次未被檢測出來。進一步研究將觀察內源性競爭機制影響miRNA下游靶基因的表達變化與信號通路的調控，明確miRNA,circRNA和mRNA之間的關系，探索OA中circRNA的miRNA海綿作用機制；擴大樣本進行臨床驗證，應用OA患者的外周血驗證篩選出的目標circRNA，進行診斷OA微創(chuàng)、快速、易得的生物標志物的探索，為進一步闡明OA的發(fā)病機制及疾病的干預靶點提供理論依據。