LC-MS/MS法測定血塞通注射液中五種皂苷成分的含量

云南省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院，云南 昆明 650011

三七(Panaxnotoginseng(Burk.)F. H. Chen)為五加科人參屬植物，是我國名貴中藥材，是云南道地中藥材資源。血塞通注射液為三七提取物制劑，主要成份為三七總皂苷，有活血祛瘀、通脈活絡(luò)等功效，主要用于中風(fēng)偏癱、瘀血阻絡(luò)證，動脈粥狀硬化性血栓性腦梗塞、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞見瘀血阻絡(luò)證者，臨床應(yīng)用廣泛并且療效確切，是一種具有重要應(yīng)用前景的中藥品種。血塞通注射液的現(xiàn)行質(zhì)量標準為國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標準WS3-B-3590-2001(Z)-2011，標準規(guī)定的含量測定所用方法為HPLC法[1]，檢測時間為60min，耗時較長而且靈敏度低。其主要成分三七總皂苷和三七三醇皂苷的含量測定的標準方法收載于《中國藥典》2015版[2、3]，三七三醇皂苷的測定也采用HPLC法，測定時長為90分鐘。LC-MS/MS技術(shù)是近年最新發(fā)展起來的重要的分離和分析方法，擁有液相色譜的優(yōu)越分離性能，串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)相較于單質(zhì)譜(MS)具有更高選擇性、更高靈敏度和更高準確度，LC-MS/MS具有分析范圍廣，分離能力強，定性分析結(jié)果可靠，自動化程度高等優(yōu)點[4]。運用LC-MS/MS技術(shù)能夠避免繁瑣和復(fù)雜的衍生化前處理，同時能夠得到化合物保留時間、分子量及特征離子對等豐富的信息。在對未知成分的研究中，通過質(zhì)譜檢測器給出的大量結(jié)構(gòu)信息，結(jié)合同類已知結(jié)構(gòu)化合物的裂解規(guī)律，即可對未知成分進行分析；在已知成分的測定中，相較于傳統(tǒng)色譜法具有更高準確度和靈敏度[5]。檢索現(xiàn)有的研究文獻，對血塞通注射液進行有效成分測定的方法多為液相色譜法[6-13]，檢測時長最短為24min[7]，應(yīng)用LC-MS/MS測定三七總皂苷中一個或幾個皂苷成分的研究文獻也有報道，但研究對象為三七原料[14-15]或其他品種的注射液[16]，應(yīng)用LC-MS/MS對血塞通注射液中三七總皂苷進行測定的文獻未見報道。研究建立一種運用LC-MS/MS法對血塞通注射液中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、人參皂苷Re、三七皂苷R1快速準確定量的方法，相對于血塞通注射液的現(xiàn)行質(zhì)量標準，大大提高了檢測效率。并成功運用該方法對來自云南不同生產(chǎn)企業(yè)的血塞通注射液進行了含量測定，為云南血塞通注射液的生產(chǎn)企業(yè)提供了提升藥品標準、提高藥品質(zhì)量的依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC-30A高效液相色譜儀(含在線脫氣機、二元泵、自動進樣器，日本島津公司)、TRIPLE QUAD 5500型質(zhì)譜儀(美國 AB Sciex公司)、CPA225D 型分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司)、UPH-IV-90Z優(yōu)普超純水機(成都超純科技有限公司)。

1.2 材料 人參皂苷Rg1(Ginsenoside Rg1，批號：110703-201529，純度95.0%)、人參皂苷Rb1(Ginsenoside Rb1，批號：110704-201424，純度93.7%)、人參皂苷Re(Ginsenoside Re，批號：110754-201525)、人參皂苷Rd(Ginsenoside Rd，1批號：10704-201424)、三七皂苷R1(Notoginsenoside R1，批號：110745-201318)和三七總皂苷(Notoginseng Total Saponins，批號：110870-201002，含量以三七皂苷R1 6.9%、人參皂苷Rg1 28.0%、人參皂苷Rb1 29.7%、人參皂苷Re 3.8%、人參皂苷Rd 7.3%計)以上對照品購于中國食品藥品檢定研究院。甲醇(色譜級，德國默克公司)，乙腈(色譜級，德國默克公司)，超純水。血塞通注射液收集于云南省不同企業(yè)，具體見表1。各待測物的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖見圖1。

2 方法

2.1 分析條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：CAPCELL CORE C18柱(2.1 mm I.D.×150 mm, 2.7 μm，SHISEIDO)；柱溫：30 ℃；流動相： A-B(水-乙腈)梯度洗脫，梯度洗脫程序如下,見表2；分析時間為 15.0 min；流速：0.300 mL/min；進樣量：1.00 μL。對照品的提取 MRM 色譜圖和樣品的MRM色譜圖比對見圖2。

表2 液相系統(tǒng)梯度洗脫程序

2.1.2 質(zhì)譜條件 采用多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)的掃描方式下正負離子同時監(jiān)測，離子源為 ESI 源，源噴射電壓設(shè)置為 5500 和-4500 V，源溫度(TEM)550℃，霧化氣壓力為55 psi，接口持續(xù)加熱，碰撞反應(yīng)氣使用氮氣，氣簾氣壓力為 35 psi，Q1 和 Q3 分辨率均為 0.1 Da，駐留時間(dwell time)為 80 ms。

將每個皂苷成分的人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、人參皂苷Re、三七皂苷R1對照品溶液(濃度約1 μg/mL)分別打入質(zhì)譜中，用MRM模式正負離子同時掃描，對前體離子(Q1)、產(chǎn)物離子(Q3)、去簇電壓(DP)和碰撞能量(CE)進行優(yōu)化，經(jīng)過優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)在正離子模式下，五種皂苷成分的響應(yīng)強度均優(yōu)于負離子的響應(yīng)強度。本實驗采用正離子對定量、負離子對定性的方式對五種皂苷成分進行測定。由于負離子對不用于定量檢測，所以未對負離子對進行質(zhì)譜條件的優(yōu)化。正離子模式下的監(jiān)測離子對、去簇電壓(DP)及碰撞能量(CE)見表3。數(shù)據(jù)處理采用 AB Sciex公司提供的 Analyst軟件，1.6版本。五種皂苷成分的一級質(zhì)譜及二級質(zhì)譜產(chǎn)生的主要裂解碎片見表3和圖3。

表3 五種皂苷成分的LC-MS/MS數(shù)據(jù)

2.2 對照品溶液的制備 分別稱取人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、人參皂苷Re、三七皂苷R1對照品適量，使用甲醇溶解并配制成一定濃度的貯備液，供質(zhì)譜條件優(yōu)化用。取三七總皂苷對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解并定容，制得三七總皂苷儲備液，濃度為含三七總皂苷1.0775 mg/mL。于-20 ℃下保存。

2.3 供試品溶液的制備 取血塞通注射液適量，按照一定比例，用甲醇稀釋定容后，用0.45 μm濾膜過濾后制得供試品溶液，于4 ℃下保存。

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 標準曲線、檢測限和定量限 取三七總皂苷儲備液，采用梯度稀釋法，用甲醇由高到低分別稀釋成8個濃度(4310 ng/mL，2155 ng/mL，1077.5 ng/mL，538.75 ng/mL，269.38 ng/mL，134.69 ng/mL，67.34 ng/mL)，0.45 μm濾膜過濾后，取1.0 μL進樣，記錄峰面積。以對照品進樣濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得標準曲線方程。將三七總皂苷儲備液用甲醇逐步稀釋并進行測定，以信噪比S/N=10和S/N=3時各對照品溶液的濃度為定量限和檢測限。

2.4.2 精密度、回收率和穩(wěn)定性 取血塞通注射液，按照適當比例稀釋，得到中間液，再將中間液用兩倍的稀釋梯度稀釋為高、中、低三個不同濃度的供試液，用0.45 μm濾膜過濾后，取1μl進樣，每個濃度的供試液平行測定6份，按“2.1”項下的分析條件對供試液中的人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、人參皂苷Re、三七皂苷R1進行定量分析記錄峰面積，帶入當日制作的標準曲線中計算出5個皂苷的濃度，并計算RSD值。供試液于4 ℃下保存，于24 h后同法再次測定，計算出5個皂苷的濃度，并計算RSD值。

取供試品溶液，于4 ℃下保存，分別于0 h、24 h、48 h 測定五種皂苷的濃度，平行測定6份，考察供試品溶液的穩(wěn)定性。

精密量取供試品溶液1.0 mL，加入甲醇1.0 mL旋渦混勻后，取1.0 μL進樣，測定五種皂苷的峰面積，帶入標準曲線中計算濃度(記錄為A濃度)。精密量取高、中、低(4156 ng/mL、2078 ng/mL、1039 ng/mL)三個濃度水平的對照品溶液1.0 mL，分別加入到1.0 mL的供試品溶液中，旋渦混勻后，制得含有高、中、低濃度的三七總皂苷的供試品加樣回收溶液(外加對照品的濃度值為2078 ng/mL、1039 ng/mL、519 ng/mL)，每個濃度平行制備 6 份進行測定，測定供試品加樣回收溶液中五種皂苷的峰面積，帶入標準曲線分別計算出五種皂苷在加樣回收溶液中的含量(記錄為B濃度)，B濃度與A濃度的差值即為實測的對照品濃度值。帶入按回收率公式：實測的對照品濃度值/外加對照品的濃度值×100%。計算五種皂苷的回收率。

2.5 樣品中五種皂苷成分含量測定 分別取“表1”中9個批次的血塞通注射液作為樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按上述方法進行檢測，記錄五種皂苷的色譜峰面積，代入標準曲線，計算樣品中五種皂苷的成分的含量。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)驗證

3.1.1 標準曲線、檢測限和定量限標準曲線的制備 以對照品進樣濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制曲線并進行線性回歸，得回歸方程。相關(guān)系數(shù)為r>0.9988 ，線性關(guān)系良好，所得回歸方程、線性范圍、LOD 和 LOQ 見表4。

表4 五種皂苷成分的回歸方程、線性范圍、LOD和LOQ

3.1.2 精密度、回收率和穩(wěn)定性 5 種皂苷的日內(nèi)精密度及日間精密度的RSD值分別小于 4.14%和 4.87%，說明方法精密度良好，詳見表5和表6。供試品溶液于4 ℃下保存，分別于0 h、24 h、48 h 測定五種皂苷的濃度，結(jié)果顯示供試品溶液穩(wěn)定性較好，RSD≤7.32%，具體數(shù)據(jù)詳見表7。5 種皂苷低、中、高 3 種濃度的加樣回收率范圍為 94.02%～106.20%，表明方法回收率良好。

表5 血塞通注射液中五種皂苷成分測定的日內(nèi)和日間精密度

表6 供試品溶液穩(wěn)定性考察結(jié)果 (n=6)

表7 高中低不同濃度供試液的回收率考察 (n=6)

3.2 血塞通注射液樣品中的五種皂苷成分的含量測定9批血塞通注射液中的的五種皂苷成分的含量測定結(jié)果見表8。其中人參皂苷Rg1的含量范圍為28.39%～37.48%、人參皂苷Rb1的含量范圍為28.75%～43.01%、人參皂苷Rd的含量范圍為6.11%～11.53%、人參皂苷Re的含量范圍為2.945～6.10%、三七皂苷R1的含量范圍為5.82%～9.29%。由此可看出云南地產(chǎn)的，不同企業(yè)、不同批次的血塞通注射液中的五種皂苷成分的含量范圍跨度不大，且都符合現(xiàn)行血塞通注射液藥品質(zhì)量標準“國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標準WS3-B-3590-2001(Z)-2011”的要求。來自同一生產(chǎn)企業(yè)的不同生產(chǎn)批號的血塞通注射液的五種皂苷成分的含量范圍差異較小，可見生產(chǎn)工藝都較為成熟穩(wěn)定。

表8 血塞通注射液中五種皂苷成分含量測定結(jié)果 (n=3)

4 討論

人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、人參皂苷Re、三七皂苷R1五種成分的對照品均使用甲醇溶解后，直接進入質(zhì)譜進行調(diào)諧，結(jié)果顯示負離子模式下，每個被分析物均有2～3對特征離子對，詳見表9。而在正離子模式下，每個被分析物都只有一對信號響應(yīng)較好的特征離子對。綜合比較每個被分析物正負離子對，發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、人參皂苷Re、三七皂苷R1 在正離子模式下的離子對響應(yīng)值均比負離子模式下的離子對響應(yīng)值高，所以采用正負離子同時監(jiān)測，用正離子對進行定量，負離子對用來定性的方式對血塞通注射液中5中皂苷成分進行測定。因人參皂苷Rd和人參皂苷Re是同分異構(gòu)體，在正離子模式下，擁有幾乎相同的離子對，僅依靠質(zhì)譜是無法通過提取檢測離子對來對人參皂苷Rd和人參皂苷Re分別單獨定量的，所以本實驗對液相色譜的條件進行探索，選用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm,Waters)和CAPCELL CORE C18色譜柱(2.1 mm I.D.×150 mm, 2.7 μm，SHISEIDO)試圖對5種皂苷成分進行分離，實驗結(jié)果顯示在同樣的洗脫順序下，CAPCELL CORE C18色譜柱在9分鐘內(nèi)將人參皂苷Rd(保留時間8.87 min)和人參皂苷Re(保留時間7.49 min)分離開來，而ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱無法分離5個皂苷成分(5個成分保留時間均在5.3 min左右)，若要提高分離度需要增加流動相的洗脫梯度，時測定時間延長，故本實驗選擇CAPCELL CORE C18色譜柱。

三七總皂苷作為血塞通注射液的主要有效成分，包括人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、人參皂苷Re、三七皂苷R1。每一個成分都有其獨特的藥理活性，其中人參皂苷作為主要成分，具有天然抗氧化作用，大量的研究表明人參皂苷Rg1對神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)都有影響，可以抑制細胞凋亡、擴張血管、抗衰老，并對運動疲勞的恢復(fù)有一定作用[17]。人參皂苷Rb1具有促智作用、心血管保護作用、降血糖的作用[18]。人參皂苷Re具有抗心肌缺血、作用，可影響心肌細胞的CYP450酶和ANP基因的表達[19]。人參皂苷Rd能夠發(fā)揮抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[20]。三七皂苷R1具有抗炎，防止缺血再灌注損傷的作用[21]。實驗中，對來自3家云南不同企業(yè)的共計9批血塞通注射液進行了含量測定，結(jié)果顯示三七總皂苷含量跨度較大，最低78.67%，最高95.30%，且同一生產(chǎn)企業(yè)不同批號間的三七總皂苷含量以及每個皂苷組分的含量都有明顯差異(詳見表8)，說明生產(chǎn)企業(yè)對于原料的質(zhì)量控制及投料工藝還有改進優(yōu)化的空間。再者，因為不同的皂苷都有其不同的藥理活性，今后可否將三七總皂苷中每一種皂苷成分單獨作為原料來研發(fā)新的三七制劑，這樣可以制造出適應(yīng)癥更確切，質(zhì)量更加便于控制的三七制劑，真正運用到做到中藥現(xiàn)代化發(fā)展中。

血塞通注射液的主要輔料為氯化鈉，由于無機鹽離子在質(zhì)譜中無法被氣化，在高溫下容易附著于離子源管路中，對質(zhì)譜儀造成一定污染。處于對測量設(shè)備的保護，需要在進入質(zhì)譜前盡可能去除樣品中的鈉離子，但是樣品進行脫鹽前處理(如液-液萃取法)，將會增加實驗步驟，給測量結(jié)果帶入一定誤差。由于本實驗測定的五種皂苷成分的保留時間均大于5 min，故本實驗運用質(zhì)譜系統(tǒng)與液相系統(tǒng)之間的三通分流泵，設(shè)定程序?qū)⑶? min的流動相直接排入廢液管路而不進入質(zhì)譜，通過流動相帶走鈉離子，減少了對質(zhì)譜系統(tǒng)的損害的同時也不影響測定結(jié)果。

綜上，實驗成功建立并驗證了一套運用LC-MS/MS整合測定血塞通注射液中的五種皂苷成分的方法，該方法靈敏度高，精密度好，檢測時長較血塞通注射液現(xiàn)行標準大大縮短，為血塞通注射液的標準提高提供理論依據(jù)。同時，本實驗的研究結(jié)果為后續(xù)血塞通注射液肌肉注射后的藥代動力學(xué)研究提供了優(yōu)化后的質(zhì)譜條件和五種皂苷在血塞通注射液中的含量信息。