HPLC法測定心痛顆粒中阿魏酸含量

陳文明 廖建萍（通訊作者） 歐陽榮 范金茹 王芳 李珊 肖望重 黃莉

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 湖南 長沙 410007）

心痛顆粒是根據(jù)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院范金茹教授多年臨床經(jīng)驗總結(jié)而成的經(jīng)驗方發(fā)展而來，原使用劑型為湯劑，由柴胡、川芎、郁金、桃仁、蒲黃、瓜蔞皮、甘草等10味藥組成，具有活血化瘀，行氣止痛的功效。主要用于不穩(wěn)定型心絞痛屬氣郁痰瘀互結(jié)證的治療。前期研究結(jié)果表明該方在改善冠心病合并頸動脈斑塊證屬痰瘀互結(jié)氣郁患者中醫(yī)證候方面明顯優(yōu)于西藥[1]；與常規(guī)治療不穩(wěn)定性心絞痛的西藥合用在改善中醫(yī)證候、緩解心絞痛、停減硝酸甘油使用及降低血清MMP-2濃度等方面均明顯優(yōu)于單用西藥[2]。本研究擬建立心痛顆粒中阿魏酸的含量測定方法，用于制劑的質(zhì)量控制，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1.儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀；島津AUX220型電子分析天平；SK5200H型超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；DHG101型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）。

1.2 試藥

阿魏酸對照品（批號：181218），購自中國食品藥品檢定研究院；心痛顆粒由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院生產(chǎn)（批號：20181109、20181227、20190110）；甲醇為色譜醇，水為純化水，其余均為分析純。

2.方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XD3-C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇-1%醋酸溶液（30:70）；流速1ml/min；檢測波長321nm；柱溫25℃；進(jìn)樣量10μl。理論板數(shù)按阿魏酸峰計算應(yīng)不低于4000。

2.2 實驗溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 取心痛顆粒約2.0g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50ml，稱定重量，超聲處理30分鐘，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.2 陰性對照品溶液的制備 取除川芎外的心痛顆粒其余處方量藥材，按心痛顆粒制備工藝制備缺川芎藥材的陰性對照樣品，照“2.2.1”項下方法制備缺川芎藥材的陰性對照品溶液。

2.2.3 對照品溶液的制備 取阿魏酸對照品適量，精密稱定，置棕色容量瓶中，加70%甲醇制成每1ml約含20μg的溶液，作為對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 干擾實驗 按“2.1”項色譜條件，取“2.2”項下3種溶液各20μl，依次進(jìn)樣檢測。結(jié)果顯示，供試品溶液中其他成分未干擾測定。高效液相色譜圖見圖1～圖3。

圖1 阿魏酸對照品

圖2 心痛顆粒供試品

圖3：缺川芎藥材陰性對照品

2.3.2 線性范圍的考察 精密吸取對照品溶液2、4、6、8、10μl，依次注入液相色譜儀，按“2.1”項色譜條件測定，以阿魏酸進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：Y=14.277，X=6.2134，r=0.9999（n=5）。結(jié)果表明，阿魏酸進(jìn)樣量在0.048～0.24μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.3 精密度實驗 精密吸取對照品溶液5μl，重復(fù)進(jìn)樣6次，測得阿魏酸峰面積值。結(jié)果峰面積的RSD為0.68%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性實驗 取心痛顆粒樣品6份，按“2.2.1”項方法制備供試品溶液，按上述色譜條件分別測定阿魏酸的峰面積。結(jié)果峰面積的RSD為1.16%（n=6），表面該實驗方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性實驗 精密吸取同一供試品溶液，分別在0，4，8，12，16，24h時進(jìn)樣測定阿魏酸的峰面積。結(jié)果峰面積的RSD為0.93%（n=6），表明心痛顆粒供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收實驗 取已知含量的同一批號心痛顆粒樣品9份，平均分為3組，分別按樣品中阿魏酸量的80%、100%、120%加入阿魏酸對照品溶液，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，并計算加樣回收率，見表1。

表1 樣品中阿魏酸加樣回收率測定結(jié)果（n=9）

2.3.7 樣品測定 取3個批次的心痛顆粒樣品，按“2.2.1”項方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定各批次心痛顆粒中阿魏酸含量，見表2。

表2 心痛顆粒中阿魏酸含量測定結(jié)果

考慮到心痛顆粒處方藥材不同產(chǎn)地、不同批次間阿魏酸含量的差異，結(jié)合實驗研究過程中測量誤差，參照文獻(xiàn)報道[11-12]中有關(guān)阿魏酸含量的限度要求，擬確定心痛顆粒中阿魏酸的含量限度設(shè)定為不少于0.18mg·g-1。

3.討論

3.1 檢測波長的選擇

采用紫外分光光度法，將阿魏酸在200～400nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果在321nm波長處有最大吸收，與《中國藥典》2015版一部“川芎”項下的檢測波長一致，同時供試品測定時在該波長處無干擾。因此，檢測時選擇321nm作為檢測波長。

3.2 流動相的選擇

根據(jù)藥典及文獻(xiàn)資料報道[3-9]，阿魏酸用HPLC法測定含量，選用的流動相有乙腈-0.1%冰醋酸、乙腈-0.1%磷酸、甲醇-0.2%磷酸、甲醇-1%醋酸等，前期實驗中，對以上流動相均進(jìn)行了考察比較，結(jié)果采用甲醇-1%醋酸（30:70）為流動相，色譜峰基線平穩(wěn)，分離度良好，理論板數(shù)符合要求。

3.3 含量測定指標(biāo)的選定

一般來說，制劑的質(zhì)量控制主要是對主藥有效成分的含量進(jìn)行測定。根據(jù)心痛顆粒的組方原則，以疏肝豁痰化瘀法立方，方中柴胡疏肝解郁，瓜蔞清熱化痰、寬胸散結(jié)，川芎活血祛瘀、行氣止痛，又善能調(diào)肝，同為君藥。川芎中主含苯肽類、酚酸、生物堿等多種成分，其中酚酸類成分阿魏酸具有改善血液流動性、抑制血小板聚集、預(yù)防血栓形成等藥理作用[10]，其與心痛方主治病證氣郁痰瘀互結(jié)型不穩(wěn)定型心絞痛相吻合。因此選用阿魏酸含量作為該制劑質(zhì)量控制的主要測定指標(biāo)。

3.4 樣品溶液的提取

供試品溶液制備時比較了加熱回流提取和超聲提取，結(jié)果兩種方法均能將阿魏酸基本提取完全，為簡化操作步驟，減少能耗，本實驗采用超聲提取30min提取心痛顆粒樣品。