肺腺癌患者胸腔積液EGFR、ALK、VEGF蛋白表達與性別、年齡及吸煙的關系

孫小迪，張麗媛，韓宜秀，李若葆，林濤，王柏林，黃琰

(濰坊醫學院臨床醫學院，山東濰坊261053)

目前，惡性腫瘤居于我國居民死亡原因的第2位，僅次于心腦血管疾病，其中肺癌的發病率和病死率居所有腫瘤首位。肺癌最常見的組織病理學類型為腺癌，胸腔積液是晚期肺腺癌最常見的并發癥之一。分子靶向治療是晚期肺腺癌患者最重要的治療手段，基因檢測對于選擇合理的分子靶向治療方案非常重要。表皮生長因子受體(EGFR)、棘皮動物微管相關蛋白4(EML4)間變性淋巴瘤激酶(ALK)、血管內皮生長因子(VEGF)作為肺癌最重要的驅動因子均已取得重大研究進展，但存在中小醫院不能獨立開展基因檢測、檢查費用昂貴等一系列問題[1]。對于肺腺癌合并胸腔積液患者，通過胸水細胞蠟塊檢測蛋白表達，可為靶向治療選擇提供更為簡便的方法。基于此，本研究通過免疫組織化學方法檢測肺腺癌患者胸腔積液EGFR、ALK、VEGF蛋白表達情況，探討3種因子蛋白表達與患者臨床特點的相關性，從而為肺癌的有效治療提供指導。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 篩選濰坊醫學院附屬醫院2015年5月～2018年4月經病理確診的肺癌患者92例，男43例、女49例，年齡42～85(61.68±8.30)歲。患者病理診斷根據2015年世界衛生組織(WHO)頒布的肺腫瘤組織學分類標準，病理分期按國際抗癌聯盟(UICC)最新公布的第8版肺癌TNM分期。入組標準：①組織類型為肺腺癌；②UICC第8版肺癌TNM分期為Ⅳ期；③合并胸腔積液；④胸水細胞蠟塊經HE染色查找到腫瘤細胞；⑤有完整可靠的病歷資料。排除標準：①既往有其他惡性腫瘤病史；②曾接受胸腔灌注化學藥物治療；③胸水細胞蠟塊經HE染色未查找到腫瘤細胞。

1.2 細胞蠟塊的制作 將送檢胸水樣本加入保存液，靜置1 h；棄去上清液，留取底部沉淀少于50 mL，搖勻。倒入50 mL離心管，2 000 r/min離心5 min，棄去上清液(血性標本需加入醋酸乙醇10 mL，振蕩均勻，2 000 r/min離心5 min，去除血細胞干擾)。將沉淀加入甲醛溶液5 mL，振蕩，2 000 r/min離心5 min，棄去上清液。加95%乙醇10 mL，振蕩，2 000 r/min離心5 min(對于沉淀較少的標本，換用1.5 mL離心管，12 000 r/min高速離心)。常規取以上處理胸水樣本，擦鏡紙包裹，放入取材盒，快速脫水處理3 h，包埋，切片。

1.3 胸水細胞HE染色 將石蠟切片置于烘箱中76 ℃烤4 h，取出切片立即放入二甲苯Ⅰ中15 min、二甲苯Ⅱ中15 min至透明。將切片取出稍甩去二甲苯，依次放入無水乙醇Ⅰ5 min、無水乙醇Ⅱ 5 min、95%乙醇5 min、90%乙醇5 min、80%乙醇5 min、70%乙醇5 min；蒸餾水沖洗3～5次，稍甩干水分后蘇木素染色5～10 min，自來水沖洗3次；放入1%鹽酸乙醇中5～10 s，自來水沖洗3次；放入1%氨水10～20 s，蒸餾水沖洗3次。1%伊紅液染色2～3 min。依次放入70%乙醇1 min、80%乙醇1 min、95%乙醇Ⅰ2 min、95%乙醇Ⅱ2 min、無水乙醇Ⅰ3～5 min、無水乙醇Ⅱ3～5min；中性樹膠封片。顯微鏡下篩檢，92例均查見腫瘤細胞。

1.4 胸腔積液EGFR、ALK、VEGF蛋白表達檢測 采用免疫組化法，所有抗體及工作液均購自福州邁新公司。將HE染色查見腫瘤細胞的蠟塊制作4 μm厚切片，76 ℃烤片4 h。一抗選用EGFR、ALK、VEGF，按照一抗要求進行Eli Vision兩步法染色，DAB顯色，再以蘇木素復染，用中性樹膠封固，在顯微鏡下進行觀察。EFGR蛋白表達判定標準：細胞質和細胞膜棕黃色顯色為(+)，無棕黃色顯色為(-)。ALK蛋白表達判定標準：細胞中存在很強的顆粒狀胞質染色為(+)，但應排除一些已知染色因素，如肺泡巨噬細胞中淺色胞質點狀著色、神經來源細胞染色、腺上皮染色、淋巴細胞浸潤中一些散在的淋巴網狀細胞染色；細胞內不存在強顆粒狀胞質染色為(-)。VEGF蛋白表達判定標準：細胞胞質呈棕黃著色為(+)，細胞胞質未著色為(-)。染色結果均由兩位病理醫師共同閱片，以組織學樣本診斷結果為標準。細胞蠟塊IHC制片背景清晰，核結構完整，著色部位正確。

1.5 統計學方法 采用SPSS21.0軟件進行統計學處理。計數資料以百分比表示，EGFR、ALK、VEGF蛋白表達與性別、年齡及是否吸煙的相關性采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胸水腫瘤細胞HE染色鏡下表現 腫瘤細胞核大、深染，核質比例高，細胞大小及形態(多形性)與正常細胞比較差異明顯，核分裂象增多。

圖1 HE染色鏡下腫瘤細胞圖像(400×)

2.2 胸腔積液EGFR、ALK、VEGF蛋白表達 92例晚期肺腺癌患者EGFR蛋白表達陽性44例，陽性率為47.83%；ALK蛋白表達陽性14例，陽性率為15.22%；VEGF蛋白表達陽性37例，陽性率為40.22%；其中同時存在EGFR和ALK蛋白表達陽性1例，同時存在EGFR和VEGF蛋白表達陽性4例，同時存在VEGF和ALK蛋白表達陽性2例，三種蛋白表達均為陰性患者4例。

2.3 胸腔積液EGFR、ALK、VEGF蛋白表達與患者性別、年齡及吸煙的關系 女性、不吸煙肺腺癌患者EGFR蛋白表達陽性率分別高于男性、吸煙者(P均<0.05)，不同年齡之間EGFR蛋白表達陽性率無統計學差異(P>0.05)；年齡<60歲患者ALK蛋白表達陽性率高于≥60歲患者(P<0.05)，不同性別、是否吸煙間ALK蛋白表達無統計學差異(P均>0.05)；不同性別、年齡及是否吸煙患者VEGF蛋白表達陽性率無統計學差異(P均>0.05)。3種蛋白陽性表達與肺腺癌患者性別、年齡及吸煙的關系見表1。

表1 3種蛋白陽性表達與肺腺癌患者性別、年齡及吸煙的關系

3 討論

晚期肺腺癌合并胸腔積液患者體質較差，傳統檢查及治療手段多難以耐受，精準靶向治療已成為晚期肺腺癌的患者的首選治療手段。EGFR、ALK、VEGF為肺腺癌發生發展的重要驅動基因，是當前晚期肺腺癌患者靶向治療的研究熱點，通過細胞蠟塊結合免疫組化技術檢測肺癌患者胸腔積液EGFR、ALK、VEGF蛋白表達簡便易行[2]。

EGFR是一種上皮生長因子細胞增殖和信號傳導受體，屬于ErbB受體家族的一員。EGFR在許多實體腫瘤中存在高表達或異常表達，與腫瘤細胞增殖、血管生成、腫瘤侵襲轉移及細胞凋亡的抑制有關，是決定患者是否能夠應用EGFR抑制劑治療的先決條件[3]。本研究結果顯示，晚期肺腺癌合并胸腔積液患者EGFR蛋白表達陽性率為47.83%，與Zhang等[4]結論基本一致。有研究表明[5,6]，EGFR陽性表達與患者種族、性別、是否吸煙、病理類型密切相關，且在亞洲女性、非吸煙腺癌患者中陽性表達率較高。本研究結果顯示，在晚期肺腺癌合并胸腔積液患者中，女性、不吸煙患者EGFR表達陽性率高于男性、吸煙患者，差異具有統計學意義。EML4-ALK融合基因于2007年首次被Soda等[7]發現，其由EML4基因與ALK基因重排形成。細胞蠟塊是晚期非小細胞肺癌(NSCLC) ALK檢測的良好替代物，多個回顧性研究均證實NSCLC細胞蠟塊中ALK重排發生率約為5%。研究顯示，中國NSCLC患者ALK表達陽性率為3%～11%[8]。楊文麗等[9]研究顯示，EML4-ALK融合基因表達更容易發生在女性、年齡≤60歲、不吸煙或少吸煙的肺腺癌患者。這可能與雌激素水平有關。本研究僅對晚期肺腺癌合并胸腔積液患者進行檢測，發現ALK表達陽性率為15.22%，且多發生于<60歲年輕患者，與性別、是否吸煙無關。有研究還發現，EGFR表達陰性患者中，ALK表達陽性率較高[10]。VEGF廣泛分布于人體的各個器官組織中，是一種能夠產生多種生物學效應的細胞因子。其與血管內皮細胞上特異性酪氨酸激酶受體結合，可促進血管生成，也是迄今發現作用最強的血管生成因子。本研究發現，在晚期肺腺癌合并胸腔積液的患者中，VEGF陽性表達率約為40.22%，且與性別、年齡、是否吸煙無關。此與葉麗新[11]報告類似。大多數研究認為，同一個患者一般不會同時發生兩種或多種蛋白表達[12,13]，但是本研究有少數患者同時存在2種蛋白陽性表達，提示EGFR、ALK及VEGF蛋白表達可能存在相互聯系。但是，本研究例數較少，EGFR、ALK及VEGF表達之間是否真正具有相關性還有待加大樣本進行深入研究。

胸腔積液是晚期肺腺癌患者最常見的并發癥之一，常導致胸悶、氣促、肺不張、肺部感染等，嚴重影響患者的生活質量，故積極尋求合理的治療方案對晚期肺腺癌患者至關重要。胸水細胞學檢查可為合并胸腔積液肺腺癌患者查找致病基因提供便捷檢測手段[14]，分子靶向治療晚期肺腺癌患者也已取得極大進展。對于胸腔積液EGFR、ALK、VEGF蛋白表達陽性患者可行基因測序等檢查，進一步行個體化分子靶向治療。