葉酸代謝酶基因多態性與胚胎停止發育的相關性

孔梅，戚宇紅，張晶，支雪榮

(1烏魯木齊友愛醫院，烏魯木齊830017；2新疆維吾爾自治區婦幼保健院)

近年來，國內臨床胚胎停止發育的發生率呈逐年上升趨勢。該病發機制非常復雜[1]，其中葉酸缺乏和葉酸代謝相關基因缺陷是胚胎發育異常的重要誘導因素[2]。葉酸又名維生素B9，是機體必不可少的營養物質，因自身無法合成，需通過腸道外途徑吸收[3]。葉酸以5-甲基四氫葉酸的形式存在于血漿中，并通過合成嘌呤和胸腺嘧啶來參與核酸、蛋白質和磷脂的代謝，因為不能被直接利用，故必須通過一系列代謝酶的催化來實現其生理活性[4]。因此，參與體內葉酸代謝的酶如亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)、甲硫氨酸合成酶還原酶(MTRR)、還原葉酸載體(RFC-1)及蛋氨酸合酶(MTR)等基因的多態性與胎兒的生長發育緊密相關[5,6]。為此，本研究就葉酸代謝酶的基因多態性與胚胎停止發育的關系進行了探討。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2017年3月～2018年6月在本院就診經B超確認有胚胎停止發育史的婦女(胚胎停育組)114例，年齡(31.256±3.918)歲，體質量(63.417±3.729)kg，產次(1.424±0.217)次，孕周(8.731±2.246)周。胚胎停止發育診斷標準：頭臀長度≥7 mm，孕囊平均直徑≥25 mm，無心跳。排除標準：宮腔畸形或宮腔內環境感染，夫妻雙方有家族性遺傳疾病，有化學或化工藥物接觸史，有心、肝、腎等重要臟器疾病等。隨機抽取同期有一次正常生育史、無不良妊娠史的婦女125例(對照組)，年齡(33.426±2.741)歲，體質量(62.389±2.915)kg，產次(1.265±0.108)次，孕周(8.425±1.537)周。兩組臨床資料比較均無統計學差異(P均>0,05)。本研究獲醫院倫理委員會批準實施，入組女性均自愿參加并簽署知情同意書。

1.2 葉酸代謝酶基因多態性檢測 抽取受試者外周血5 mL存于真空抗凝試管中，5 000 r/min 4 ℃離心20 min，收集中層白細胞，-20 ℃保存。采用基因組DNA提取試劑盒獲取基因組DNA，經核酸蛋白分析儀鑒定純度和濃度，OD260/OD280介于1.8～2.0，保存于-20 ℃。采用RCP-RFLP法檢測MTHFR C677T、MTRR A66G、RFC-1 A80G及MTR A2756G等位點葉酸代謝相關酶等位基因和基因型分布頻率，分析四個基因位點與胚胎停止發育的相關性。選擇各位點相應PCR-RFLP擴增引物序列，提取獲得的基因組DNA完成純度鑒定后進行PCR擴增，PCR擴增所用體系共計10 μL，包括1 μL的基因組DNA模板(30 ng/μL)，5 μL的2×Master Mix，0.5 μL的20×引物以及3.5 μL純水。以95 ℃預變性5 min后，95 ℃變性30 s，然后59 ℃退火30 s，最后72 ℃延伸60 s，40個循環結束后，72 ℃延伸5 min。擴增后PCR產物用限制性內切酶酶切后進行瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.3 葉酸利用能力等級判定 參照Li等[7]研究，葉酸利用能力風險等級的判定是以MTHFR C677T TT、MTRR A66G、RFC-1 A80G、MTR A2756G等位點GG型的出現頻率為指標，分為四個風險等級：突變純合型分布頻率<10.0%時可認為機體葉酸利用能力正常，劃分為未發現風險等級；突變純合型的分布頻率為11.0%～35.0%時為低風險；突變純合型分布頻率在36.0%～65.0%時為中度風險；而≥66.0%可判定為高風險。

1.4 統計學方法 采用SPSS22.0統計軟件處理數據。計數資料以百分比表示，采用χ2檢驗進行組間比較，Logistic回歸分析用于判斷各位點與胚胎停止發育的相關性。數據均通過Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組MTHFR、MTRR、RFC-1及MTR等位基因分布情況 RFC-1 A80G、 MTR A2756G、MTRR A66G基因中A和G等位基因頻率在胚胎停育組和對照組間無統計學差異(P均>0.05)。而胚胎停育組中MTHFR基因C677T位點T等位基因的頻率分布在胚胎停育組和對照組中有統計學差異(P<0.05)。見表1。

表1 兩組等位基因頻率分布比較(%)

2.2 兩組 MTHFR、MTRR、RFC-1及MTR的基因型頻率分布情況 胚胎停育組中MTHFR基因C677T位點TT突變純合型、MTRR基因的A66G位點的GG突變純合型頻率均高于對照組(P均<0.05)。RFC-1基因A80G位點以及MTR基因A2756G位點AA、AG和GG型的頻率在胚胎停育組和對照組間無統計學差異(P均>0.05)。見表2。

2.3 葉酸代謝酶基因多態性與胚胎停育的關系Logistic分析結果顯示，MTHFR C677T位點的突變純合型TT型與胚胎停止發育相關，其胚胎停育的風險高于CC型和CT型 (P均<0.05)，MTHFR C677T TT基因型是發生胚胎停育的危險因素。MTRR A66G GG基因型與胚胎停止發育的風險同樣高于AA、AG基因型(P均<0.05)，攜帶GG基因型是發生胚胎停育的危險因素。RFC-1 A80G、MTR A2756G的位點突變與胚胎停育的風險無關。見表3。

表2 兩組基因型頻率分布比較[ 例(%)]

表3 葉酸代謝酶基因多態性與胚胎停育的Logistic分析結果

2.4 兩組葉酸利用能力比較 胚胎停育組中葉酸利用能力在未發現風險、低度風險分布比例分別為3.51%和14.91%，低于對照組的31.20%和45.60%(P均<0.05)。而胚胎停育組在中度風險和高度風險的分布比例分別為49.12%和32.46%，高于對照組14.40%和8.80%(P均<0.05)。

3 討論

由葉酸代謝酶基因突變引起酶活性降低，可能導致同型半胱氨酸向甲硫氨酸轉化受阻，引起S-腺苷甲硫氨酸水平降低，抑制DNA甲基轉移酶活性從而影響DNA甲基化，誘發胚胎停止發育、早產、妊娠期高血壓等產科疾病[8,9]，葉酸代謝酶基因突變可能與胚胎停止發育發生有關。MTHFR、MTRR、RFC-1和MTR是目前與臨床產科診斷相關的葉酸代謝酶，本研究通過探究這4種基因多態性與胚胎停止發育的相關性，以希望對存在潛在胚胎停止發育患者的診斷有所幫助。

MTHFR基因突變類型有20余種，其中最具臨床意義的突變位點是C677T突變。突變表現為三種基因型，即野生純合型CC、突變雜合型CT和突變純合型TT型；突變后MTHFR酶活性降低，降低程度與基因型有關，其中突變雜合型CT型活性降低30%左右，突變純合型TT型的活性甚至降低60%以上[10, 11]。本研究等位基因頻率分布結果顯示，MTHFR C677T位點中T等位基因在胚胎停育組中的分布與對照組存在差異。而基因型頻率分析結果顯示，在胚胎停育組中MTHFR基因C677T位點TT突變純合型頻率高于對照組。這提示MTHFR C677T TT型頻率增加與胚胎停止發育有關。MTRR是同型半胱氨酸再甲基化途徑中的重要酶，在甲硫氨酸代謝途徑中起重要作用，作為甲基供體幫助維持機體蛋氨酸、四氫葉酸水平，減少同型半胱氨酸的蓄積毒性[12]。MTRR主要突變類型有A66G、S175L等，其中A66G突變是目前最主要也是研究最多的突變。該位點突變后使得蛋氨酸被異亮氨酸代替，酶活性降低，進而影響同行半胱氨酸代謝。突變所表現的三種基因型中，MTRR 66AA酶活性最高，其次是66AG，66GG活性最低[13]。本研究結果顯示，胚胎停育組MTRR A66G位點A、G等位基因所占比例與對照組相比無差異。但胚胎停育組MTRR基因A66G位點GG型的頻率高于對照組。這提示MTRR A66G GG型頻率的增加與胚胎停止發育有關。Logistic分析結果顯示，攜帶MTHFR基因TT突變純合型、MTRR A66G GG型是胚胎停止發育的危險因素。RFC-1酶通過協助5-甲基四氫葉酸進入胞內來幫助核酸、蛋白質和磷脂的合成，所以RFC-1基因突變的發生通過影響葉酸轉運增加胎兒宮內發育缺陷的風險[14,15]。MTR是同型半胱氨酸蛋白酶的再甲基化的重要催化酶，該基因的突變通過阻礙再甲基化導致同型半胱氨酸蓄積，進一步引發胎盤血栓栓塞，而血栓栓塞的發生極易引發胎盤停止發育[16]。本研究發現RFC-1 A80G位點和MTR A2756G位點AA型、AG型和GG型頻率在胚胎停育組和對照組分布無統計學差異。即RFC-1基因的A80G位點和MTR基因的A2756G位點的突變純合型基因頻率的增加與胚胎停止發育無關，這個結果也通過進一步的Logistic分析得到確證。

綜上所述， MTHFR C677T位點和MTRR A66G位點與胚胎停止發育相關，對有MTHFR C677T位點和MTRR A66G位點基因突變孕產婦應積極進行干預，以預防和減少胚胎停止發育情況的發生。