α倒捻子素與載α倒捻子素納米制劑促進小膠質細胞攝取Aβ的作用比較

王大元，宋華華，胡朦，李娟，谷曉，高小玲

(上海交通大學醫學院藥理與化學生物學系，上海 200025)

阿爾茨海默病(AD)是一種最常見的神經退行性疾病，65歲以上老年人患病率為10%～30%[1]，而且仍以10萬人/年的速度增加，預期到2050年將達1.31億[2]。AD患者腦內會產生大量異常聚集的β-淀粉樣蛋白(Aβ)，對神經細胞有較大毒性，是導致和加劇AD癥狀的關鍵因素[3, 4]。因此，促進Aβ的清除成為緩解甚至治療AD的有效方法。目前Aβ清除策略主要是通過主動免疫的疫苗或被動免疫的抗體介導清除。雖然這些方法可以起到一定Aβ清除效果，但仍會引起自身免疫性腦膜炎以及小膠質細胞激活[5, 6]。此外，這些Aβ抗體還可能同正常神經元的Aβ前體蛋白結合而導致正常神經元遭受免疫攻擊[5]。鑒于目前免疫療法仍存在嚴重的不良反應，我們考慮是否可以利用機體自身Aβ清除機制為Aβ清除提供一個更安全有效的方法。我們的前期研究顯示，山竹殼提取物多酚黃酮類衍生物α倒捻子素(αM)可以上調低密度脂蛋白受體的表達，在腦內和外周分別增強小膠質細胞和肝臟細胞對Aβ的清除;然而αM等多酚類物質在體內穩定性差、溶解度低，在靶器官藥物濃度低。進一步研究發現，將αM包載入聚乙二醇聚乳酸(PEG-PLA)納米制劑后可以克服這些問題。因此，我們在體外比較αM和載αM的PEG-PLA(NP-αM)對小膠質細胞攝取Aβ的促進效果，從而為AD提供一種以促進Aβ清除為策略的納米藥物療法。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠BV2小膠質瘤細胞系(購自中科院北京細胞庫)、小鼠原代小膠質細胞取自新生24 h的C57BL/6小鼠(小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司)；MePEG3000-PLA4000由華東理工大學贈送；αM、香豆素6熒光素、DAPI、PBS磷酸鹽緩沖液購自美國Sigma-Aldrich公司；DMEM培養基(高糖)、胰酶、胎牛血清、鏈霉素-青霉素雙抗、GlutaMAX購自美國Thermo Fisher公司；羧基熒光素標記的Aβ(Fam-Aβ)購自美國AnaSpec公司；膽酸鈉購自中國醫藥集團上海化學試劑公司；磷鎢酸購自上海大合化學；HPLC用甲醇、HPLC用乙腈購自美國TEDIA 公司。

1.2 納米制劑的制備 ①空載PEG-PLA納米制劑(NP)制備：電子天平稱取20 mg MePEG-PLA后加入1 mL二氯甲烷中。待固體物質溶解后，加入2 mL 1 %膽酸鈉水溶液。220 W超聲處理約3 min使其形成O/W乳液，該過程在冰上進行以吸收探針超聲產生的熱量。取18 mL 0.5 %膽酸鈉水溶液加入超聲處理乳液中，使用磁力攪拌器系統攪拌5 min。使用旋轉蒸發儀蒸發至不再產生氣泡，14 000 g離心45 min。加入1 mL生理鹽水復溶，保存于4 ℃冰箱中。②載αM的PEG-PLA 納米制劑(NP-αM)制備：采用乳化-溶劑蒸發法。稱取1 mg αM和20 mg MePEG-PLA，然后加入到1 mL的二氯甲烷中。待固體物質溶解后，向其中加入2 mL 1 %膽酸鈉水溶液。為了將其制成O/W乳液，進行220 W超聲處理，此過程需要約3 min，在冰上進行以吸收探針超聲產生的熱量力。將18 mL 0.5 %膽酸鈉水溶液加入到超聲處理乳液中，并使用磁力攪拌器系統攪拌5 min。使用旋轉蒸發儀蒸發至不再產生氣泡，14 000 g離心45 min。最后，使用1.5 cm×20 cm Sepharose瓊脂糖凝膠CL-4B柱除去未包裹的αM。使用香豆素6(Cou6)分別標記NP和NP-αM，并以其分別作用BV2細胞和原代小膠質細胞。

1.3 納米制劑表征方法 使用Zetasizer粒徑電位儀測定納米制劑光散射粒徑和zeta電位。①NP濃度使用濁度法測定：首先使用甲醇配制0.5、0.4、0.3、0.2、0.1 mg/mL的納米制劑標準液，350 nm UV下檢測吸光度并繪制標準曲線。納米制劑稀釋20倍后使用350 nm UV檢測吸光度，代入標準曲線線性方程計算納米制劑的濃度。②NP-αM中的αM濃度使用HPLC檢測：選取甲醇0.5、1、2.5、5、10 μg/mL αM標準液，乙腈溶解并稀釋NP-αM 100倍，靜置5 min后取上清液100 μL作進樣用。HPLC的操作參數如下：使用C18反相色譜柱，紫外檢測波長為325 nm，甲醇為流動相，5 mmol/L pH 3.0的甲酸銨為水相，比例為94∶6；流速1 mL/min；進樣體積20 μL。以標準曲線溶液測得的峰面積作為縱坐標，以標準曲線濃度作為橫坐標繪制標準曲線，將納米制劑測得的峰面積代入標準曲線方程中計算NP-αM中αM的濃度。制劑的包封率和載藥量采用以下公式計算： 載藥量(%)：C1×N/C2×100；包封率(%)：C1×N/C2/(m1/m2)×100。其中，C1為HPLC測得的αM濃度，N為檢測時的稀釋倍數，C2為NP的濃度，m1為αM的投藥量，m2為NP的投入量。

1.4 原代小膠質細胞提取和培養 原代小膠質細胞取材于野生型出生24 h的C57BL/6小鼠。首先使用75 %乙醇棉球消毒頭部，斷頭剝除腦殼和腦膜，取出大腦皮層部分，放于冷的DMEM中(于冰上操作)。小心剝離皮層組織上的血管膜和非皮層腦組織，使用消毒后的專用剪刀剪碎皮層。使用膠頭滴管將皮層組織轉移至盛有5 mL 0.25 % 胰蛋白酶的平皿中，于37 ℃消化5 min。將消化后的皮層轉移至裝有10 mL完全培養液的50 mL離心管中終止消化，向其中加入 10～20 μL的DNA酶減輕黏稠度，輕柔吹打20次左右。接著使用離心機1 600 r/min 離心5 min，棄去上清液，用5 mL完全培養液重懸沉淀，使用血球計數板對細胞懸液進行計數，稀釋至合適的濃度后，種植于使用多聚賴氨酸包被后的75 cm2的細胞培養瓶中。第2天換新的完全培養液，往后每隔3 d使用完全培養液半量換液，到第7天時進行搖取膠質細胞的步驟。搖取膠質細胞前，先將培養瓶用封口膜封口并固定在搖床上，將條件設定為200 r/min，37 ℃。搖取3.5 h后將培養瓶取出，吸取上層培養液并加入2 mL完全培養液，輕柔吹打成細胞懸液。取少量細胞懸液使用0.4 %臺盼藍染色以區別死細胞，在顯微鏡下進行細胞計數。按照需要的細胞濃度加入一定體積的完全培養液，按照5×103個/孔的種植密度種于多聚賴氨酸包被過的96孔板中，最后放入CO2培養箱培養，48 h后可以用于后續實驗。

1.5 小膠質細胞攝取納米制劑的熒光共聚焦顯微鏡觀察 使用多聚賴氨酸包被玻璃底96孔盤(熒光共聚焦顯微鏡專用)，小膠質細胞(BV2或原代小膠質細胞)的種植密度為5×103個/孔，貼壁后且狀態良好方可用于實驗。稱取1 mg αM加入到1 mL DMSO中溶解，作為給藥儲備液。各組制劑或藥物使用DMEM稀釋至所需濃度，含有DMSO藥物在稀釋時要使得DMSO在培養液中的含量小于0.1 %。實驗分3組，NP(NP，15 μg/mL)組、αM+NP(αM，400 ng/mL；NP，15 μg/mL)組、NP-αM(含400 ng/mL αM和15 μg/mL NP)組。在37 ℃細胞培養箱中孵育24 h。接著，使用PBS清洗細胞3遍，在37 ℃下使用4 %甲醛固定細胞10 min，PBS清洗細胞3遍，DAPI染核液先稀釋至0.5 mg/mL，與細胞在室溫避光孵育30 min，PBS清洗細胞3次，每次時間為5 min。制備好的細胞樣本用Leica TCS SP8激光共聚焦顯微鏡觀察采集照片，激發光波長分別為405、488 nm。

1.6 小膠質細胞攝取納米制劑或Aβ定量檢測 小膠質細胞(BV2或原代小膠質細胞)種于多聚賴氨酸包被的96孔板中，種植密度為5×103個/孔，貼壁后且狀態良好方可用于實驗。稱取1 mg αM加入到1 mL DMSO中溶解，作為藥物儲備液。各組制劑或藥物使用DMEM稀釋至所需濃度，含有DMSO藥物的在稀釋時要使得DMSO在培養液中的含量小于0.1 %。①納米制劑的攝取：實驗分為3組，NP(NP，15 μg/mL)組、αM+NP(αM，400 ng/mL ；NP，15 μg/mL)組、NP-αM(含15 μg/mL NP和400 ng/mL αM)組，各組在37 ℃細胞培養箱中孵育24 h。②Aβ的攝取：實驗分為4組，Aβ(Aβ，2 μg/mL)組，NP+Aβ組(NP，15 μg/mL；Aβ，2 μg/mL)，αM+Aβ組(αM，400 ng/mL；Aβ，2 μg/mL)，NP-αM+Aβ組(NP-αM，含15 μg/mL NP和400 ng/mL αM；Aβ，2 μg/mL)。在37 ℃細胞培養箱中孵育23 h后，加入Fam-Aβ繼續共同孵育1 h。上述藥物作用結束后，使用PBS清洗細胞3遍，在37 ℃下使用4 %甲醛固定細胞10 min，PBS清洗細胞3遍，DAPI染核10 min，PBS清洗細胞3遍，最后使用高內涵掃描系統進行定量分析。

2 結果

2.1 納米制劑表征 制備NP-αM粒徑為(150.1±14.6)nm，分散系數(PDI)為0.102±0.025， zeta電位為(-14.28±2.83)mV。NP粒徑為(141.6±15.2)nm，PDI為0.110±0.021，zeta電位為(-14.59±2.31)mV。NP-αM的載藥量為(2.60±0.22)%，包封率為(53.6±4.7)%。透射電子顯微鏡下NP和NP-αM圖像見圖1。

圖1 透射電子顯微鏡下NP(A)和NP-αM(B)圖像

2.2 αM與NP-αM促進小膠質細胞攝取Aβ定量比較 高內涵掃描系統檢測結果顯示，與Aβ組比較，NP-αM+Aβ組和αM+Aβ組可以促進BV2細胞或原代小膠質細胞對Aβ的攝取(P均< 0.05)，但與αM+Aβ組相比，NP-αM+Aβ組作用更顯著(P< 0.05)。見表1。

表1 αM與NP-αM促進小膠質細胞攝取Aβ定量比較

注：與Aβ組比較，*P< 0.05；與αM+ Aβ組比較，△P< 0.05；表中數據為細胞內納米制劑Fam熒光量。

2.3 αM或NP-αM影響小膠質細胞攝取納米制劑定性觀察 熒光共聚焦顯微鏡觀察顯示， 與NP組比較，NP+αM組或NP-αM組BV2細胞或原代小膠質細胞攝取的納米制劑較多。見圖2。

圖2 熒光共聚焦顯微鏡下BV2細胞(A)和原代小膠質細胞(B)攝取NP圖像

2.4 αM與NP-αM促進小膠質細胞攝取納米制劑定量比較 高內涵掃描系統定量檢測發現，αM+NP或NP-αM均可以顯著促進BV2細胞或原代小膠質細胞攝取納米制劑。αM+NP組相對于NP組，BV2細胞和原代小膠質細胞對NP攝取量分別提高了5.5倍和3.9倍；NP-αM組相對于NP組，BV2細胞和原代小膠質細胞對NP的攝取量分別提高了6.6倍和4.5倍，組間比較差異均有統計學意義(P均< 0.05)。見表2。

表2 αM與NP-αM促進小膠質細胞攝取納米制劑定量比較

注：與NP組比較，*P< 0.05；與αM+NP組比較，△P< 0.05；表中數據為細胞內納米制劑Cou6熒光量。

3 討論

小膠質細胞是中樞神經系統的常駐細胞，占全部細胞的5%～12 %[7]。小膠質細胞參與神經系統的建立(如突觸修剪等)[8～10]；在大腦受到損傷時，小膠質細胞參與損傷修復[11, 12]；作為中樞神經系統的巨噬細胞，小膠質細胞還具有監視和清除腦內廢物的功能[13～15]。小膠質細胞對AD的發生發展也發揮許多重要作用，可以通過釋放炎癥調節因子參與疾病進程[16]。Aβ大量聚集是AD的關鍵致病因素，小膠質細胞對Aβ清除也發揮關鍵作用[7, 17, 18]。

研究發現，山竹殼提取物多酚黃酮類衍生物αM可以上調低密度脂蛋白受體的表達，在腦內和外周分別增強小膠質細胞和肝臟細胞對Aβ的清除[19, 20]，αM可作為一種能促進小膠質細胞清除Aβ的潛在候選藥物。但是，αM等多酚類物質在體內穩定性差、溶解度低，特別是在靶器官的藥物濃度低等缺點大大限制了其后續研究和應用[21]。而將αM包載入PEG-PLA納米制劑后，可以克服這一問題。但是包載后的αM促進小膠質細胞清除Aβ的效果與αM單獨作用相比會發生何種改變還不清楚。因此，我們首先制備了NP和NP-αM制劑，從表征中可以看出納米制劑的穩定性較好，大小均一，分散均勻。繼而，我們探究NP-αM對小膠質細胞攝取Aβ的促進作用，并與αM單獨作用的效果進行比較。將αM和NP-αM分別作用于BV2細胞或原代小膠質細胞后，發現αM和NP-αM均可以顯著促進細胞攝取Aβ，但NP-αM比αM的作用更強。這一結果表明，αM促進小膠質細胞清除Aβ的效果在包載入納米制劑后有了顯著提升。由于αM和NP-αM的給藥濃度、時間均相同，而空白NP未促進小膠質細胞攝取Aβ，因此我們繼續探究是何種原因導致了NP-αM的攝取促進效果。我們利用共聚焦顯微鏡定性觀察和高內涵掃描系統定量檢測后均發現，αM或NP-αM均可以顯著增強小膠質細胞對納米制劑的攝取。NP-αM作用后，其內所含的αM除了發揮促進小膠質細胞攝取Aβ的作用外還促進了小膠質細胞攝取更多的納米制劑，而這些納米制劑中包載了αM，更多的αM進入細胞，最終產生了更強促Aβ攝取的藥效。因此認為NP-αM相比于αM可以更好地發揮促進小膠質細胞攝取Aβ的作用，這一作用是由于αM可以促進小膠質細胞攝取更多的納米制劑從而使更多的αM進入細胞的結果。納米藥物具有眾多普通藥物無法實現的功能和優勢，可以增強水溶性差藥物的溶解度、提高藥物生物利用率和體內分布率、延長藥物的體內半衰期、消除血腦屏障對藥物作用的限制等。因此，NP-αM有望為AD提供一個以納米藥物為基礎、以Aβ清除為策略的更好治療方法。