人良性前列腺增生組織性激素相關受體ERα、ERβ、GPR30、AR的表達及其與前列腺增生的關系

褚靖，潘斌，黃鵬玉，葉嘯，謝濤

(1暨南大學附屬珠海醫院，廣東珠海519000；2暨南大學附屬第一醫院510630)

前列腺增生癥是老年男性最常見的疾病，有超過90%的80歲以上男性會出現前列腺增生癥狀。老齡和有功能的睪丸是老年男性發生前列腺增生的基礎，性激素水平紊亂是前列腺增生發生的必要條件。雌/雄激素兩者協同作用，共同調控前列腺的發育和生理病理過程。雌激素作為男性體內另外一種重要的激素，與骨成熟、脂質代謝等密切相關。雌激素受體α(ERα)、雌激素受體β(ERβ)是經典雌激素受體，它們定位于細胞核，與雌激素結合之后被激活，進而啟動一系列與轉錄相關的反應。最近另外一種非核定位的非經典雌激素受體G蛋白偶聯雌激素受體30(GPR30)被發現在心臟、大腦、肝臟以及卵巢等組織有表達。深入開展雌激素參與前列腺發育和增生的研究，有望能揭示前列腺增生的性激素調控本質。本文檢測人良性前列腺增生組織和正常前列腺組織ERα、ERβ、GPR30、雄激素受體(AR)表達水平，以探討ERα、ERβ、GPR30、AR在良性前列腺增生癥發生發展中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 暨南大學附屬珠海醫院2016年7月～2017年7月收治住院前列腺增生患者48例(BPH組)，年齡(68.20±9.25)歲；患者均行經尿道前列腺電切術，術后病理明確診斷為良性前列腺增生組織。另選擇同期行膀胱癌根治術患者19例(Normal組)，年齡(63.29±8.92)歲。兩組年齡比較無統計學差異(P<0.05)。取良性前列腺增生組織標本及膀胱癌根治術患者病理診斷為正常前列腺組織標本進行檢測分析，本研究獲得醫院倫理委員會批準及患者知情同意。

1.2 檢測方法

1.2.1 檢測試劑 Tris、SDS、甘氨酸為Sigma-Aldrich集團旗下品牌VETEC產品；飛克特超敏ECL液、SDS-PAGE凝膠快速配制劑盒均購自大連美倫生物技術有限公司；一抗兔ERα、ERβ、GPR30及AR多克隆抗體購于北京博奧森公司；羊抗兔二抗購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；DAB染色盒購于基因科技(上海)股份有限公司。

1.2.2 組織ERα、ERβ、GPR30、AR mRNA表達檢測 采用Real-time PCR法。組織RNA按照TRIzol試劑說明書提取，并用紫外分光光度計檢測RNA濃度及純度。引物由上海生工公司合成。各基因的引物序列如下: AR正鏈5’ - TTG GAT GGC TCC AAA TCA C-3’,反鏈5’- GCA ATG ATA CGA TCG AGT TCC -3’; ERα正鏈5’- TGG GCT TAC TGA CCA ACC TG - 3’, 反鏈5’- CCT GAT CAT GGA GGG TCA AA- 3’; ERβ正鏈5’- AGA GTC CCT GGT GTG AAG CAA - 3’, 反鏈5’- GAC AGC GCA GAA GTG AGC ATC- 3’；GPR30正鏈5’- TGGCACCCGACTAACCC - 3’, 反鏈5’- CACAGGAACCCTAAAGCAAA - 3’；β-actin正鏈5’- AGAGCTACGAGCTGCCTGAC - 3’, 反鏈5’- AGCACTGTGTTGGCGTACAG - 3’ 。取總RNA 1 μg，采用Toyobo的逆轉錄試劑盒進行逆轉錄翻譯。反應條件如下：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s, 60 ℃ 15 s, 72 ℃ 30 s,共40個循環。每個樣本重復3次，統計并計算mRNA的表達量

1.2.3 組織ERα、ERβ、GPR30、AR 蛋白表達檢測 采用Western blotting法。組織標本經常規研磨裂解離心變性制成樣品蛋白提取液；按SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒說明書配膠，上樣量10 μL，分級恒壓電泳(80 V、20 min，120 V、90 min)，置于冰中100 mA恒流濕轉60 min； 5%脫脂牛奶封閉液室溫封閉1 h；隨后滴加一抗4 ℃過夜；二抗37 ℃ 1 h；于暗房里滴加ECL發光液曝光，顯影定影，保存結果。

2 結果

2.1 兩組前列腺組織ERα、ERβ、GPR30、AR mRNA表達水平 Normal組ERβ mRNA水平與BPH組相比無統計學差異(P>0.05)；與Normal組相比，BPH組GPR30 mRNA水平降低(P<0.05)，ER α mRNA及AR mRNA表達水平上升(P均<0.05)。見圖1、表1。

圖1 兩組前列腺組織ERα、ERβ、GPR30、AR mRNA表達電泳圖及柱形圖

2.2 兩組前列腺組織ERα、ERβ、GPR30及AR的蛋白表達水平 Normal組前列腺組織ERβ蛋白表達水平與BPH組相比無統計學差異(P>0.05)；與Normal組比較，BPH組前列腺組織GPR30蛋白低表達(P<0.05)，ERα蛋白、AR蛋白表達水平上升(P均<0.05)。見圖2、表2。

表1 兩組前列腺組織ERα、ERβ、GPR30、AR mRNA表達比較

3 討論

前列腺是一種性激素依賴的器官，而性激素有雄激素和雌激素，它們是通過其受體在前列腺的生長發育中發揮作用。因此，雌激素受體ERα、ERβ、GPR30及雄激素受體AR在BPH的發生發展中起著重要作用。當前人們基于整體的基因組、蛋白組、細胞與細胞相互作用的微環境水平對前列腺增生進行了多種研究。有學者采用高通量芯片和蛋白組學技術檢測了臨床前列腺增生樣本的miRNA/mRNA表達譜和蛋白表達譜，首次構建了中國人種前列腺高通量數據集(miRNA、mRNA和蛋白)[1]。但是關于前列腺增生的病因學和病理生理學還不十分明確，其發病機制存在上皮-間質細胞學說、生長因子學說、激素-內分泌學說、細胞凋亡與基因調控學說等等多種假說。

圖2 兩組前列腺組織ERα、ERβ、GPR30、AR蛋白表達電泳圖及柱形圖

表2 兩組前列腺組織ERα、ERβ、GPR30、AR蛋白表達比較

基于雄激素的作用機制，人們開發出了一系列治療前列腺增生的臨床藥物。利用人為改變體內雌雄激素比例的方法，人們已經成功地在大鼠、狗等動物身上誘導了前列腺增生。研究發現，在前列腺內部雌雄激素比例的失調與前列腺細胞的增殖及凋亡有著非常密切的關系[2, 3]，雌激素與前列腺增生以及前列腺癌等疾病的發生關系密切[4, 5]。 研究發現，男性體內30%雌激素直接由睪丸產生，而70%是腎上腺和睪丸所產生的雄激素經芳香化酶作用轉化合成的。老齡和有功能的睪丸是老年男性發生前列腺增生的基礎。研究表明患有BPH的中老年男性，睪丸因老齡功能減退，導致雄激素水平下降，但雌激素保持原有水平或升高，由此雌/雄激素的比例增加[6]。雌/雄比例失調是前列腺增生的致病關鍵因素之一。

ERα主要分布在間質細胞中；ERβ則主要在上皮細胞中表達，在間質細胞中表達較低。ERα和ERβ雖在結構上具有高度相似，且在某些組織中共同表達，但是二者被激活之后所表現出來的反應卻不同。ERα對前列腺間質細胞起增殖作用。雌激素能夠通過前列腺間質細胞的受體，快速激活間質細胞中MAPK信號通道，從而促進前列腺的增生[7]。ERβ對前列腺上皮細胞的增殖分化產生作用。前列腺周帶活檢中獲得的細胞在培養后發現ERβ mRNA的表達，但沒有ERα mRNA的表達，認為雌激素是通過ERβ信號途徑影響前列腺上皮細胞的生長[8]。前列腺基質細胞增生是BPH的主要類型，其占增生組織的60%左右[9]。本研究結果顯示，ERα在BPH中表達水平與前列腺正常組織相比，表達含量明顯增加；前列腺正常組織中的ERβ的表達水平與BPH相比無明顯差異。證實ERα的表達水平與前列腺細胞增生速率的變化有關。在BPH中，ERα的過度表達可能是前列腺間質細胞加速增生的一個因素。

AR在上皮和間質細胞中均表達。AR是一種類固醇受體，在前列腺生長發育和調節分泌反應中起重要影響。雄激素能夠通過AR介導刺激上皮和間質細胞的增殖，進而促進BPH的發生[10]。本研究結果表明，與前列腺正常組織相比，AR在BPH中為高表達。證實AR表達水平升高，促進前列腺增生，在BPH中，ERα和AR的高表達可能共同刺激前列腺細胞增生。GPR30主要在上皮細胞中表達。GPR30是G蛋白偶聯受體超家族成員之一，雌激素可通過GPR30快速激活細胞內的第二信號系統，影響細胞生長發育狀態。Yang等[11]認為抑制雌激素介導GPR30的細胞凋亡，從而使上皮細胞加速增殖，導致BPH的發生。本結果顯示，與前列腺正常組織相比GPR30的蛋白表達水平在BPH中明顯減少。證實BPH中雌/雄激素比例失調，GPR30表達水平下降，GPR30表達水平和BPH可能存在負向相關性。

本研究通過觀察在前列腺正常組織和BPH中ERα、β，GPR30及AR的表達情況，推測雌/雄激素比例失調、ERα和AR表達水平升高、GRP30表達下降，可使前列腺細胞加速增殖，進而促進前列腺的增生。