人良性前列腺增生組織性激素相關(guān)受體ERα、ERβ、GPR30、AR的表達(dá)及其與前列腺增生的關(guān)系

褚靖，潘斌，黃鵬玉，葉嘯，謝濤

(1暨南大學(xué)附屬珠海醫(yī)院，廣東珠海519000；2暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院510630)

前列腺增生癥是老年男性最常見的疾病，有超過90%的80歲以上男性會(huì)出現(xiàn)前列腺增生癥狀。老齡和有功能的睪丸是老年男性發(fā)生前列腺增生的基礎(chǔ)，性激素水平紊亂是前列腺增生發(fā)生的必要條件。雌/雄激素兩者協(xié)同作用，共同調(diào)控前列腺的發(fā)育和生理病理過程。雌激素作為男性體內(nèi)另外一種重要的激素，與骨成熟、脂質(zhì)代謝等密切相關(guān)。雌激素受體α(ERα)、雌激素受體β(ERβ)是經(jīng)典雌激素受體，它們定位于細(xì)胞核，與雌激素結(jié)合之后被激活，進(jìn)而啟動(dòng)一系列與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的反應(yīng)。最近另外一種非核定位的非經(jīng)典雌激素受體G蛋白偶聯(lián)雌激素受體30(GPR30)被發(fā)現(xiàn)在心臟、大腦、肝臟以及卵巢等組織有表達(dá)。深入開展雌激素參與前列腺發(fā)育和增生的研究，有望能揭示前列腺增生的性激素調(diào)控本質(zhì)。本文檢測人良性前列腺增生組織和正常前列腺組織ERα、ERβ、GPR30、雄激素受體(AR)表達(dá)水平，以探討ERα、ERβ、GPR30、AR在良性前列腺增生癥發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 暨南大學(xué)附屬珠海醫(yī)院2016年7月～2017年7月收治住院前列腺增生患者48例(BPH組)，年齡(68.20±9.25)歲；患者均行經(jīng)尿道前列腺電切術(shù)，術(shù)后病理明確診斷為良性前列腺增生組織。另選擇同期行膀胱癌根治術(shù)患者19例(Normal組)，年齡(63.29±8.92)歲。兩組年齡比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。取良性前列腺增生組織標(biāo)本及膀胱癌根治術(shù)患者病理診斷為正常前列腺組織標(biāo)本進(jìn)行檢測分析，本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)及患者知情同意。

1.2 檢測方法

1.2.1 檢測試劑 Tris、SDS、甘氨酸為Sigma-Aldrich集團(tuán)旗下品牌VETEC產(chǎn)品；飛克特超敏ECL液、SDS-PAGE凝膠快速配制劑盒均購自大連美倫生物技術(shù)有限公司；一抗兔ERα、ERβ、GPR30及AR多克隆抗體購于北京博奧森公司；羊抗兔二抗購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；DAB染色盒購于基因科技(上海)股份有限公司。

1.2.2 組織ERα、ERβ、GPR30、AR mRNA表達(dá)檢測 采用Real-time PCR法。組織RNA按照TRIzol試劑說明書提取，并用紫外分光光度計(jì)檢測RNA濃度及純度。引物由上海生工公司合成。各基因的引物序列如下: AR正鏈5’ - TTG GAT GGC TCC AAA TCA C-3’,反鏈5’- GCA ATG ATA CGA TCG AGT TCC -3’; ERα正鏈5’- TGG GCT TAC TGA CCA ACC TG - 3’, 反鏈5’- CCT GAT CAT GGA GGG TCA AA- 3’; ERβ正鏈5’- AGA GTC CCT GGT GTG AAG CAA - 3’, 反鏈5’- GAC AGC GCA GAA GTG AGC ATC- 3’；GPR30正鏈5’- TGGCACCCGACTAACCC - 3’, 反鏈5’- CACAGGAACCCTAAAGCAAA - 3’；β-actin正鏈5’- AGAGCTACGAGCTGCCTGAC - 3’, 反鏈5’- AGCACTGTGTTGGCGTACAG - 3’ 。取總RNA 1 μg，采用Toyobo的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄翻譯。反應(yīng)條件如下：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s, 60 ℃ 15 s, 72 ℃ 30 s,共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)并計(jì)算mRNA的表達(dá)量

1.2.3 組織ERα、ERβ、GPR30、AR 蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。組織標(biāo)本經(jīng)常規(guī)研磨裂解離心變性制成樣品蛋白提取液；按SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒說明書配膠，上樣量10 μL，分級(jí)恒壓電泳(80 V、20 min，120 V、90 min)，置于冰中100 mA恒流濕轉(zhuǎn)60 min； 5%脫脂牛奶封閉液室溫封閉1 h；隨后滴加一抗4 ℃過夜；二抗37 ℃ 1 h；于暗房里滴加ECL發(fā)光液曝光，顯影定影，保存結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 兩組前列腺組織ERα、ERβ、GPR30、AR mRNA表達(dá)水平 Normal組ERβ mRNA水平與BPH組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；與Normal組相比，BPH組GPR30 mRNA水平降低(P<0.05)，ER α mRNA及AR mRNA表達(dá)水平上升(P均<0.05)。見圖1、表1。

圖1 兩組前列腺組織ERα、ERβ、GPR30、AR mRNA表達(dá)電泳圖及柱形圖

2.2 兩組前列腺組織ERα、ERβ、GPR30及AR的蛋白表達(dá)水平 Normal組前列腺組織ERβ蛋白表達(dá)水平與BPH組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；與Normal組比較，BPH組前列腺組織GPR30蛋白低表達(dá)(P<0.05)，ERα蛋白、AR蛋白表達(dá)水平上升(P均<0.05)。見圖2、表2。

表1 兩組前列腺組織ERα、ERβ、GPR30、AR mRNA表達(dá)比較

3 討論

前列腺是一種性激素依賴的器官，而性激素有雄激素和雌激素，它們是通過其受體在前列腺的生長發(fā)育中發(fā)揮作用。因此，雌激素受體ERα、ERβ、GPR30及雄激素受體AR在BPH的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。當(dāng)前人們基于整體的基因組、蛋白組、細(xì)胞與細(xì)胞相互作用的微環(huán)境水平對(duì)前列腺增生進(jìn)行了多種研究。有學(xué)者采用高通量芯片和蛋白組學(xué)技術(shù)檢測了臨床前列腺增生樣本的miRNA/mRNA表達(dá)譜和蛋白表達(dá)譜，首次構(gòu)建了中國人種前列腺高通量數(shù)據(jù)集(miRNA、mRNA和蛋白)[1]。但是關(guān)于前列腺增生的病因?qū)W和病理生理學(xué)還不十分明確，其發(fā)病機(jī)制存在上皮-間質(zhì)細(xì)胞學(xué)說、生長因子學(xué)說、激素-內(nèi)分泌學(xué)說、細(xì)胞凋亡與基因調(diào)控學(xué)說等等多種假說。

圖2 兩組前列腺組織ERα、ERβ、GPR30、AR蛋白表達(dá)電泳圖及柱形圖

表2 兩組前列腺組織ERα、ERβ、GPR30、AR蛋白表達(dá)比較

基于雄激素的作用機(jī)制，人們開發(fā)出了一系列治療前列腺增生的臨床藥物。利用人為改變體內(nèi)雌雄激素比例的方法，人們已經(jīng)成功地在大鼠、狗等動(dòng)物身上誘導(dǎo)了前列腺增生。研究發(fā)現(xiàn)，在前列腺內(nèi)部雌雄激素比例的失調(diào)與前列腺細(xì)胞的增殖及凋亡有著非常密切的關(guān)系[2, 3]，雌激素與前列腺增生以及前列腺癌等疾病的發(fā)生關(guān)系密切[4, 5]。 研究發(fā)現(xiàn)，男性體內(nèi)30%雌激素直接由睪丸產(chǎn)生，而70%是腎上腺和睪丸所產(chǎn)生的雄激素經(jīng)芳香化酶作用轉(zhuǎn)化合成的。老齡和有功能的睪丸是老年男性發(fā)生前列腺增生的基礎(chǔ)。研究表明患有BPH的中老年男性，睪丸因老齡功能減退，導(dǎo)致雄激素水平下降，但雌激素保持原有水平或升高，由此雌/雄激素的比例增加[6]。雌/雄比例失調(diào)是前列腺增生的致病關(guān)鍵因素之一。

ERα主要分布在間質(zhì)細(xì)胞中；ERβ則主要在上皮細(xì)胞中表達(dá)，在間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)較低。ERα和ERβ雖在結(jié)構(gòu)上具有高度相似，且在某些組織中共同表達(dá)，但是二者被激活之后所表現(xiàn)出來的反應(yīng)卻不同。ERα對(duì)前列腺間質(zhì)細(xì)胞起增殖作用。雌激素能夠通過前列腺間質(zhì)細(xì)胞的受體，快速激活間質(zhì)細(xì)胞中MAPK信號(hào)通道，從而促進(jìn)前列腺的增生[7]。ERβ對(duì)前列腺上皮細(xì)胞的增殖分化產(chǎn)生作用。前列腺周帶活檢中獲得的細(xì)胞在培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)ERβ mRNA的表達(dá)，但沒有ERα mRNA的表達(dá)，認(rèn)為雌激素是通過ERβ信號(hào)途徑影響前列腺上皮細(xì)胞的生長[8]。前列腺基質(zhì)細(xì)胞增生是BPH的主要類型，其占增生組織的60%左右[9]。本研究結(jié)果顯示，ERα在BPH中表達(dá)水平與前列腺正常組織相比，表達(dá)含量明顯增加；前列腺正常組織中的ERβ的表達(dá)水平與BPH相比無明顯差異。證實(shí)ERα的表達(dá)水平與前列腺細(xì)胞增生速率的變化有關(guān)。在BPH中，ERα的過度表達(dá)可能是前列腺間質(zhì)細(xì)胞加速增生的一個(gè)因素。

AR在上皮和間質(zhì)細(xì)胞中均表達(dá)。AR是一種類固醇受體，在前列腺生長發(fā)育和調(diào)節(jié)分泌反應(yīng)中起重要影響。雄激素能夠通過AR介導(dǎo)刺激上皮和間質(zhì)細(xì)胞的增殖，進(jìn)而促進(jìn)BPH的發(fā)生[10]。本研究結(jié)果表明，與前列腺正常組織相比，AR在BPH中為高表達(dá)。證實(shí)AR表達(dá)水平升高，促進(jìn)前列腺增生，在BPH中，ERα和AR的高表達(dá)可能共同刺激前列腺細(xì)胞增生。GPR30主要在上皮細(xì)胞中表達(dá)。GPR30是G蛋白偶聯(lián)受體超家族成員之一，雌激素可通過GPR30快速激活細(xì)胞內(nèi)的第二信號(hào)系統(tǒng)，影響細(xì)胞生長發(fā)育狀態(tài)。Yang等[11]認(rèn)為抑制雌激素介導(dǎo)GPR30的細(xì)胞凋亡，從而使上皮細(xì)胞加速增殖，導(dǎo)致BPH的發(fā)生。本結(jié)果顯示，與前列腺正常組織相比GPR30的蛋白表達(dá)水平在BPH中明顯減少。證實(shí)BPH中雌/雄激素比例失調(diào)，GPR30表達(dá)水平下降，GPR30表達(dá)水平和BPH可能存在負(fù)向相關(guān)性。

本研究通過觀察在前列腺正常組織和BPH中ERα、β，GPR30及AR的表達(dá)情況，推測雌/雄激素比例失調(diào)、ERα和AR表達(dá)水平升高、GRP30表達(dá)下降，可使前列腺細(xì)胞加速增殖，進(jìn)而促進(jìn)前列腺的增生。