X射線交錯(cuò)互補(bǔ)修復(fù)基因3在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及臨床意義

張墨軒，馮帆，潘景臻，崔洪瑋，張健，劉偉

(1 濰坊醫(yī)學(xué)院，濰坊261053；2 臨沂市人民醫(yī)院)

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見、最具侵襲性的腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的40%[1]。根據(jù)WHO分類，膠質(zhì)瘤病理分級為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ級[2]。近年來，雖然膠質(zhì)瘤的總體治療效果有了顯著提高，但是高等級膠質(zhì)瘤患者的平均預(yù)期壽命仍僅有14個(gè)月[3]。因此，進(jìn)一步探討膠質(zhì)瘤的發(fā)生機(jī)制及其治療新靶點(diǎn)是提高膠質(zhì)瘤患者生存率的迫切需要。X射線交錯(cuò)互補(bǔ)修復(fù)基因3(XRCC3)參與同源重組修復(fù)途徑(HRR)，是癌癥易感性高度可疑候選基因[4]。最新文獻(xiàn)報(bào)道，XRCC3在膀胱癌、乳腺癌和結(jié)腸直腸癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[5,6]。然而，XRCC3在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)差異及其與預(yù)后的關(guān)系尚不清楚。為此，本研究對膠質(zhì)瘤中XRCC3的表達(dá)及其意義進(jìn)行了探討。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2008年7月～2014年7月臨沂市人民醫(yī)院住院治療的膠質(zhì)瘤患者腫瘤標(biāo)本65例，男35例、女30例，中位年齡44歲；患者均為首次手術(shù)治療，膠質(zhì)瘤診斷均經(jīng)病理檢查證實(shí)。腫瘤大小：直徑≥4 cm 51例，<4 cm 14例；腫瘤部位：位于額葉35例，顳葉19例，其他11例；膠質(zhì)瘤KPS評分：<80分34例，≥80分31例；WHO病理分級：Ⅰ～Ⅱ級31例，Ⅲ～Ⅳ級34例。另選取同期在臨沂市人民醫(yī)院因創(chuàng)傷性腦損傷行顱內(nèi)減壓術(shù)獲得的正常腦組織標(biāo)本10例及瘤旁證實(shí)為正常腦組織標(biāo)本30例進(jìn)行對照研究。本研究獲醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)通過。

1.2 膠質(zhì)瘤及正常腦組織XRCC3表達(dá)檢測 將65例膠質(zhì)瘤組織及40例正常腦組織在中性緩沖甲醛溶液中固定24 h，后經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟和包埋處理。將石蠟包埋的膠質(zhì)瘤標(biāo)本及正常腦組織標(biāo)本切成3 μ m厚的切片，隨后石蠟切片在70 ℃下烘烤1 h，二甲苯脫蠟并用順濃度梯度乙醇水化。脫蠟水化后的切片在10 mmol/L檸檬酸緩沖液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)中微波加熱進(jìn)行抗原修復(fù)，修復(fù)后自然冷卻至室溫。滴加阻斷內(nèi)源性過氧化物酶(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)室溫孵育10 min并用PBS緩沖液沖洗3次，1次2 min。用正常山羊血清(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)封閉10 min，傾去封閉液后滴加單克隆抗XRCC3抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司, 1∶100)在4 ℃過夜，PBS緩沖液沖洗3次，1次2 min。滴加抗鼠/兔IgG二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)在室溫下孵育30 min。滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)室溫孵育10 min，PBS緩沖液沖洗3次，1次2 min。加入適量新鮮配制的DAB(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)室溫暗箱孵育3～5 min，加水終止顯色，流動(dòng)水沖洗，蘇木素、鹽酸乙醇分化液和氨水返藍(lán)復(fù)染，最后行脫水、透明、封片處理。每個(gè)樣本通過免疫組化著色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行評估。陽性腫瘤細(xì)胞的百分比評分：<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>76%為4分。染色強(qiáng)度分為四個(gè)等級(強(qiáng)度評分)：陰性(0分)、淺棕色(1分)、棕色(2分)、棕褐色(3分)。將強(qiáng)度評分和百分比評分相乘產(chǎn)生得分，得分≤4分定義為XRCC3低表達(dá)，得分>4分定義為XRCC3高表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)分析XRCC3表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性，采用Kaplan-Meier分析膠質(zhì)瘤XRCC3表達(dá)與生存時(shí)間的關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 XRCC3在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)上調(diào) 免疫組化染色顯示，XRCC3在膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞核表達(dá)較弱。見圖1。正常腦組織XRCC3高表達(dá)率為20.0%(8/40)，膠質(zhì)瘤組織XRCC3高表達(dá)率為50.8%(33/65)，二者XRCC3高表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.017)。

注：A 正常腦組織；B Ⅱ級膠質(zhì)瘤組織；C Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織；D 陰性對照(未加一抗)。

圖1XRCC3在不同等級膠質(zhì)瘤中表達(dá)情況(免疫組化染色，×200)

2.2 XRCC3表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者臨床特點(diǎn)的關(guān)系 單因素分析顯示XRCC3的表達(dá)與性別、年齡、腫瘤直徑、發(fā)病部位、KPS評分等因素?zé)o關(guān)(P均>0.05)。Ⅲ～Ⅳ 級膠質(zhì)瘤XRCC3高表達(dá)率高于Ⅰ～Ⅱ 級膠質(zhì)瘤，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.019)。見表1。

2.3 XRCC3的表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后之間的關(guān)系 65例患者均進(jìn)行了跟蹤隨訪，根據(jù)XRCC3表達(dá)差異與患者生存時(shí)間繪制Kaplan-Meier生存曲線(圖2)。顯示XRCC3低表達(dá)生存時(shí)間6～108(68±3.08)個(gè)月，XRCC3高表達(dá)生存時(shí)間1～97(24±7.10)個(gè)月，兩者生存時(shí)間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)。

表1 膠質(zhì)瘤組織XRCC3表達(dá)與臨床特點(diǎn)的關(guān)系[例(%)]

圖2 不同XRCC3表達(dá)水平膠質(zhì)瘤患者生存曲線

3 討論

近年來，盡管有研究者不斷發(fā)現(xiàn)與膠質(zhì)瘤形成、入侵、進(jìn)展以及患者預(yù)后有關(guān)的分子標(biāo)志物如IDH突變、MGMT啟動(dòng)子甲基化、染色體lp / 19q雜合性缺失和TERT啟動(dòng)子突變等[8]，但是對膠質(zhì)瘤發(fā)生的確切機(jī)制仍了解不多，臨床缺少膠質(zhì)瘤有效治療方法是大家的普遍共識。目前，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了4種成熟的DNA修復(fù)途徑，分別是核苷酸切除修復(fù)、堿基切除修復(fù)、錯(cuò)配修復(fù)和雙鏈斷裂修復(fù)[9]。DNA雙鏈斷裂是最常見和最危險(xiǎn)的DNA損傷類型，可導(dǎo)致細(xì)胞基因組不穩(wěn)定，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和進(jìn)展[10,11]。DNA雙鏈斷裂具有2種主要的修復(fù)方式，即同源重組修復(fù)和非同源末端連接[7]。同源重組修復(fù)是指發(fā)生在非姐妹染色單體之間或同一染色體上含有同源序列的DNA分子之間或分子之內(nèi)的重新組合。DNA雙鏈斷裂后基因組完整性的修復(fù)是細(xì)胞抵御環(huán)境損傷的主要手段。DNA雙鏈斷裂一旦被錯(cuò)誤修復(fù)，可導(dǎo)致細(xì)胞染色體異常，引發(fā)細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[12]。

作為細(xì)胞應(yīng)對環(huán)境破壞的主要防御手段，DNA修復(fù)對維持基因組的完整性至關(guān)重要。從理論上講，DNA修復(fù)蛋白表達(dá)的減少或丟失會破壞DNA修復(fù)能力，導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，從而增加對腫瘤的易感性。然而，在腫瘤發(fā)生過程中，DNA修復(fù)蛋白的表達(dá)變化相當(dāng)復(fù)雜，有些表達(dá)下調(diào)，有些表達(dá)上調(diào)。XRCC3是參與同源修復(fù)通路中的核心蛋白之一，其基因位于人類染色體14q32.3，編碼DNA修復(fù)蛋白[11]。XRCC3蛋白是人類RAD51的同源蛋白，在同源重組修復(fù)通路中通過與其他蛋白相互作用有效修復(fù)DNA損傷[13]。目前，已在多種腫瘤組織中檢測到XRCC3異常表達(dá)。如在結(jié)直腸癌中XRCC3多態(tài)性與結(jié)直腸癌的易感性相關(guān)[14]，在乳腺癌中XRCC3與RAD51的表達(dá)呈正相關(guān)并在腫瘤中呈高表達(dá)狀態(tài)[10]。本研究顯示XRCC3在膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá)率為50.8%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常腦組織，提示XRCC3可能參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。

文獻(xiàn)報(bào)告，XRCC3對替莫唑胺導(dǎo)致的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞DNA雙鍵斷裂有修復(fù)作用，參與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的化療耐藥形成過程[2]。但是，膠質(zhì)瘤XRCC3表達(dá)與患者臨床特點(diǎn)及腫瘤分級的關(guān)系未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，XRCC3表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者性別、年齡、腫瘤大小、發(fā)病部位及KPS評分無明顯相關(guān)性；Ⅲ～Ⅳ 級膠質(zhì)瘤XRCC3高表達(dá)率顯著高于Ⅰ～Ⅱ 級膠質(zhì)瘤，XRCC3在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)與病理分級相關(guān)。有研究顯示，食管鱗癌患者XRCC3表達(dá)與放化療耐藥有關(guān)，XRCC3高表達(dá)患者生存期較短[15]；肝細(xì)胞癌患者XRCC3多態(tài)性與預(yù)后相關(guān)，XRCC3 Thr/Met和Met/Met基因型患者中位生存時(shí)間較短[16]。本研究顯示，膠質(zhì)瘤XRCC3高表達(dá)者生存時(shí)間縮短，XRCC3高表達(dá)與膠質(zhì)瘤預(yù)后不良相關(guān)。

綜上所述，XRCC3在膠質(zhì)瘤中呈高表達(dá)，病理分級越高表達(dá)越高，且高表達(dá)患者預(yù)后較差，提示XRCC3可能是膠質(zhì)瘤的1個(gè)新型診斷標(biāo)志物、預(yù)后預(yù)測因子及藥物治療靶點(diǎn)。