基于軟X射線與低場核磁檢測小麥隱蔽性害蟲玉米象

邵小龍 徐水紅 徐 文

(南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心，江蘇高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室，南京 210023)

保障儲糧品質對于維護國家糧食安全具有十分重大的意義。據相關資料顯示，我國特別是農戶的儲糧損失約為6%～9%[1]，其中儲糧害蟲的危害性最大。儲糧害蟲主要分為糧粒內部害蟲(隱蔽性害蟲)和糧粒外部害蟲，隱蔽性害蟲整個生長過程都在糧粒內部完成，肉眼無法察覺，對糧食的危害最為嚴重。玉米象是一種最常見的糧食隱蔽性害蟲，能引起糧食品質及數量的損失[2]。因此實現玉米象的早期檢出對于提高我國儲糧品質顯得尤為重要。

軟X射線作為一種快速無損的儲糧害蟲檢測技術，具有悠久的發展歷史[3,4]。圖像像素值的大小反映了X射線穿透被檢測物的衰減度，當糧粒受到害蟲感染時密度發生改變引起X射線透射率的變化，故與正常糧粒相比X成像圖片有所不同。Karunakaran等[5]研究表明軟X射線可以準確判別超過95%的未感染小麥以及受不同階段米象感染的小麥。Nawrocka等[6]使用軟X射線成像測定被谷象侵染的小麥籽粒質量損失，根據質量損失的差異來確定谷象的不同蟲態。單一的軟X射線檢測方法對于隱蔽性害蟲的早期檢出存在一定局限，Chelladurai等[7]將軟X射線與近紅外高光譜兩者聯用，大大提高了四紋豆象卵期以及早期幼蟲的檢測準確率。

低場核磁共振(low-field nuclear magnetic resonance，簡寫LF-NMR)是近些年發展起來的一種分析檢測技術，在牛奶[8]、食用油[9～11]、肉制品[12,13]等異物或摻假檢測方面表現出很好的檢測效果，低場核磁能對氫質子(特別是水)快速準確檢測，害蟲侵入糧粒內部屬于外來物，由于昆蟲個體含水率與糧粒差別很大[14]，因此低場核磁有可能作為檢測外來害蟲的方法。

本研究通過軟X射線拍攝的圖片，觀察玉米象在小麥內部的整個生長發育周期，提取未感染以及被不同階段玉米象感染小麥的紋理特征，利用LDA與QDA分類模型判斷不同分類情況下的判別準確率。將低場核磁引入儲糧害蟲檢測領域，與高清軟X射線拍攝圖片相結合，測定玉米象在小麥體內的生長發育情況，根據玉米象與小麥特征峰值比例的變化，判斷小麥是否受到玉米象感染并且處于哪種蟲態。

1 材料與方法

1.1 實驗樣品

試驗樣品小麥為硬質紅小麥，來自于南京市石埠橋糧食儲備庫，未試驗前均放在4 ℃冰箱中儲藏,為防止小麥中可能含有蟲卵，實驗前在80 ℃烘箱中烘2 h進行殺蟲處理。試驗樣蟲玉米象來源于糧食儲運國家工程實驗室(南京)培養的多代種群，置于溫度(29±1)℃、相對濕度(65±2)%條件下生長繁殖。

1.2 實驗設備

ZXFLASEE U微焦點X光檢測儀；NMI20-Analyst型核磁共振分析儀；1001-1 型電熱鼓風干燥箱；GNP-9160型隔水式恒溫培養箱；JE1001型電子天平(精度為0.01 g)萬能粉碎機。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品準備以及X射線圖像獲取

采用烘箱法調節小麥含水量12%左右，挑選約100 g小麥放入500頭玉米象成蟲置于溫度(29±1)℃、相對濕度(65±2)%條件下生長繁殖48 h后移出所有成蟲。共挑選252粒感染與未感染小麥，置于自制裝樣多孔板上每2天進行X射線圖像采集，記錄玉米象從卵、幼蟲、蛹，成蟲以及羽化而出的整個生長發育過程。

本研究中使用的軟X射線成像系統(丹東中訊科技有限公司)包含實時圖像采集，圖像和視頻保存，幾何尺寸測量等。將小麥籽粒手動放置在樣品臺的自制多孔板上，并在30 kV電位和100 μA電流下進行X射線照射采集，直到多孔板上所有的籽粒成像完成。X射線儀的其他參數設置如下：窗寬3 275，窗位5 578，亮度0，對比度2。小麥籽粒的X射線圖像以64像素mm-1的分辨率被數字化為8位灰度圖像。

1.3.2 圖像特征值的提取

紋理特征用于量化小麥籽粒灰度強度的空間分布。利用灰度共生矩陣和灰度游程矩陣共提取了小麥灰度圖像的30個紋理特征[15～17]。灰度共生矩陣反映了圖像灰度分布的方向、幅度和局部區域的綜合信息，并且使用MATLAB程序提取了24個特征：在0°，45°，90°和135°處四個方向的四個GLCM特征(能量，熵，對比度，相關性)，四個平均值和四個標準偏差[17]。灰度游程矩陣代表在對象中出現相同或相似灰度級的共線和連續像素，并且使用MATLAB程序提取了6個特征：短程，長程，灰度不均勻性，運行百分比 ，運行長度不均勻，低灰度運行[17]。

1.3.3 分類判別

分類方法參照Chelladurai 等[7]。選擇線性判別分析(LDA)和二次判別分析(QDA)作為分類判別模型, 用SAS9.4的DISCRIM程序采用差一法對未感染與不同感染階段的小麥進行分類。通過X射線拍攝的圖片，每個感染階段挑選70粒樣品進行分類判別。LDA和QDA模型的三種不同交叉驗證如下：1)五類(未感染小麥、卵期、幼蟲、蛹期以及蛀空糧粒); 2)三類(未感染小麥、卵期到成蟲視為感染階段以及蛀空糧粒);3)二類(未感染小麥與不同感染階段)。

1.3.4 橫向弛豫參數測定

實驗前，通過核磁共振波譜分析軟件中的FID(free induction decay)脈沖序列校準中心頻率。實驗時，每次稱取(2.00±0.01) g小麥樣品于直徑15 mm的核磁管中，采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)脈沖序列測定樣品的橫向弛豫參數[18,19]，每組樣品6個平行，重復3次，取平均值。設置CPMG脈沖序列的參數如下：主頻SF=19 MHz， 90°脈沖射頻脈寬P1=13 us，180°脈沖射頻脈寬P2=25 μs，采樣頻率SW=200 kHz，回波時間TE=0.2 ms，重復采樣等待時間TW=1 500 ms，回波個數NECH=3 000，重復采樣次數NS=32。

1.4 數據分析

利用LF-NMR自帶的CONTIN反演法對數據進行反演，用EXCEL(2013)軟件對反演數據進行分析和繪圖，用SAS9.4軟件進行顯著性差異分析，用SAS9.4的DISCRIM程序對所有的分類模型數據進行訓練(Statistical Analysis Systems Institute, Inc., Cary, NC, USA)。

2 結果與分析

2.1 軟X射線圖片分析

玉米象是典型的糧食隱蔽性害蟲，成蟲產卵后將卵埋置于糧粒內部，幼蟲在糧粒內生長發育，直至長成成蟲從糧粒內部羽化而出，玉米象是主要的初期性害蟲，會引起后期性蟲害滋生，造成嚴重的糧食損失[20]，因此實現玉米象的早期檢出顯得尤為重要。玉米象在同一粒小麥體內的生長周期經軟X射線檢測后得到的圖片如圖1所示，未感染小麥由于未受到蛀蝕，整體質地比較均勻，當小麥受到玉米象感染之后，被蛀蝕以及產卵部分就會比較明亮。從圖中可以看出，小麥受感染12 d玉米象處于卵期階段，感染的16 d～24 d分別為1～4齡幼蟲，1齡幼蟲體積較小而且在小麥內部活動范圍很小，沒有大范圍的侵蝕糧粒，感染的28 d玉米象處于蛹期階段然后漸漸長成成蟲并羽化而出。

圖1 未感染小麥與被不同天數玉米象感染小麥的軟X射線圖片

2.2 玉米象在小麥體內生長階段的分類結果分析

紋理特征描述的是圖像表面的紋理信息，從宏觀上反映了一些圖像灰度變化的規律[21]。未感染小麥與被玉米象不同階段感染小麥的表面紋理特征存在差異，因此紋理特征可用于不同感染階段小麥的分類判別。本文共提取了30個紋理特征，用LDA與QDA分類模型進行判別分析，從表1可以看出，兩種分類結果LDA的準確率普遍比QDA高，將未感染小麥與玉米象卵期、幼蟲、蛹期及蛀空糧粒同時進行分類判別，LDA與QDA模型對未感染小麥的分類準確率最高，達到了90%以上。LDA模型對玉米象卵期、幼蟲、蛹期及蛀空糧粒的分類準確率都在70%以上，卵期的分類準確率為74.3%，相較于Chelladurai 等[7]的研究，準確率有所提高；QDA模型的分類準確率隨著玉米象的生長發育而逐漸提升。把卵期、幼蟲以及蛹期統一歸為感染階段與未感染小麥及蛀空糧粒進行分類判別，發現兩種判別模型對于未感染及感染小麥的判別準確率都在90%以上，相對來說，蛀空糧粒的判別準確率就有點低，因為蛀空糧粒往往會與蛹期感染小麥發生錯誤分類。

表1 利用LDA與QDA分類模型對未感染小麥與受不同階段

為了得到未感染小麥與各個感染時期的分類準確率，將未感染小麥與各個不同感染時期分別進行分類判別。從表2可以看出，LDA與QDA模型對于所有感染類型的判別準確率都達到了95%以上，有的甚至為100%，未感染小麥與受玉米象卵期感染小麥兩者之間較高的判別準確率可以表明在高清X光機的幫助下，能夠清楚看到蛀蝕孔及卵的存在，因此有可能實現隱蔽性害蟲玉米象的早期檢出。

表2 利用LDA與QDA分類模型對未感染小麥與受不同階段

2.3 玉米象在小麥體內生長發育的低場核磁分析

在LF-NMR中，常以氫核(1H)作為研究對象，弛豫時間用氫質子的橫向弛豫時間表示[22]，小麥和玉米象的氫質子主要來源于水分子。一般情況下，昆蟲的含水量遠高于糧食的水分。例如，昆蟲的水分約為65%，而糧食的正常儲藏水分為12%～18%[14]。根據核磁共振弛豫時間T2反演譜圖中波峰位置的不同，可以區分處于不同狀態的水分。當水與物質結合越緊密時，相對質子自由度就越低，T2弛豫時間就越短；相反質子自由度越高時T2弛豫時間就越長[23]。結合高清X光機，在玉米象不同生長天數，挑選小麥內部只受一頭玉米象感染的籽粒進行低場核磁檢測，所得的T2反演圖譜如圖2所示，隨著感染天數的增加，第一特征峰的峰頂點呈現先向右后向左移動的趨勢，此峰代表的是小麥的特征峰(弛豫時間范圍在0.47～1.14 ms之間)，表明受玉米象感染小麥內部的水分流動性發生了改變，那是因為玉米象在小麥內部生長發育，直接取食小麥籽粒，導致小麥內部的大分子結構遭到破壞。而且除36 d以外，隨著感染天數的增加，第二特征峰表現的越來越明顯，此峰代表的是小麥內部玉米象的特征峰(弛豫時間范圍在43.29～200.92 ms之間)，36 d時，玉米象成蟲已經鉆出糧粒，蛀空糧粒相較于未感染及被感染小麥的水分含量都有所降低，導致峰的信號強度相對較弱。

圖2 玉米象在小麥體內不同生長天數的低場核磁弛豫時間T2反演圖譜

峰值比例的變化能更加直觀的反映玉米象在小麥內部的生長發育情況。如圖3所示，隨著玉米象在小麥內部生長發育，峰值比例P2b呈先下降后上升的趨勢，峰值比例P22呈先上升后下降的趨勢，在感染的12 d，變化幅度非常細小，那是因為此時的玉米象正處于卵期，還未開始蛀蝕糧粒，所以對小麥水分含量的影響可以忽略不計。從感染的12 d到24 d，峰值比例P2b與P22的變化幅度最大，P22所占比例從9.81%上升到了33.05%，此階段的玉米象孵化完成，從1齡幼蟲長成4齡幼蟲，在小麥體內活躍度增強，體積不斷變大，所以通過LF-NMR檢測顯示蟲峰信號逐漸增強，所占比例逐漸增加。從感染的24 d到30 d，峰值比例P2b與P22表現的非常平穩，P22所占比例都維持在31%以上，此時的玉米象正處于蛹期變態過程，蟲體在小麥體內保持靜止狀態，不取食糧粒。待其逐漸長成成蟲，由于成蟲水分含量相較于幼蟲與蛹期水分含量有所降低，因此峰值比例P22略有下降。在感染的36 d，成蟲羽化而出，此時的蛀空糧粒P2b急劇上升，P22急劇下降。

圖3 玉米象在小麥體內生長發育過程的峰比例P2b和P22的變化情況

3 討論與結論

本研究通過高清軟X射線拍攝的被玉米象感染小麥圖片，可以清楚看到玉米象在小麥內部生長發育的全部過程，并能觀察到在12%水分含量小麥中，玉米象在12 d左右孵化完成，整個玉米象的生長周期大約為36 d。

通過提取不同蟲態玉米象感染小麥的紋理特征，利用LDA與QDA進行分類判別，兩者都可以對未感染小麥與不同感染階段小麥進行分類，對未感染小麥的分類準確率都在90%以上，并且對未感染小麥與不同感染階段小麥進行單獨分類判別時，準確率都達到了95%以上，尤其是未感染小麥與受卵期感染小麥的分類準確率要比先前的研究高很多，例如Chelladura等[7]利用LDA與QDA分類模型研究未感染大豆與受四紋豆象卵期感染大豆的判別準確率大約為60%，較之于Karunakaran等[5]的研究，本文增加了對玉米象卵期的檢測。對玉米象卵期及幼蟲階段較高的判別準確率表明高清軟X射線有可能實現隱蔽性害蟲玉米象的早期檢出。

結合高清軟X射線拍攝的圖片進行低場核磁檢測，根據玉米象與小麥特征峰值比例的變化，能夠判斷小麥是否受到玉米象感染，并且處于哪一種蟲態。因此能夠將低場核磁檢測技術引入儲糧害蟲檢測領域，與高清軟X射線相結合，以期為糧食隱蔽性害蟲的早期檢出提供一種新的思路與方法。