響應面優化茶葉籽淀粉提取工藝及其性質研究

張芳芳 高 巍 時振振 王國釘 何坤明 白新鵬

(海南大學食品學院;生物活性物質與功能食品開發重點實驗室;熱帶多糖資源利用教育部工程研究中心，?？?570228)

淀粉是植物光合作用合成的主要的碳水化合物之一，以淀粉顆粒的形式貯存于不同植物的種子、根莖、果實中[1, 2]。據研究表明不同來源的淀粉在形態結構及理化性質上各不相同，從而導致其對應的功能性截然不同[3]。淀粉是一種越來越受歡迎的生物大分子材料，廣泛地被應用于食品工業、醫藥、化工等領域[4-6]。

茶葉籽是茶葉生產的副產物，我國是茶葉生產的故鄉，茶園面積約占2 700萬畝，茶葉籽年產量達到80萬噸[7]，大量的茶葉籽資源通常棄之不用，造成茶葉籽資源的嚴重浪費。茶葉籽中含有豐富的營養物質，如油脂、蛋白質、淀粉、茶皂素、纖維素等[7]。茶葉籽中含有質量分數約 15%～20%的淀粉，可作為替代淀粉的潛在資源[9]。目前，關于茶葉籽淀粉提取工藝的研究，國內外有少量的文獻報道[10,11]。其中，肖龍艷等[12]利用超聲波輔助提取法提取茶葉籽淀粉，其提取率達到81.93%，但只是關于其工藝的研究，缺乏對茶葉籽淀粉理化性質、顆粒大小、形態、結構特性等的綜合性研究分析。

本研究以貴州產地提供的茶葉籽為原料，通過超聲波輔助提取茶葉籽淀粉，考察超聲時間、超聲功率、液料比、超聲溫度等因素對茶葉籽淀粉提取率的影響，響應面優化超聲波輔助提取茶葉籽淀粉的最佳工藝，探討利用茶葉籽作為淀粉的替代來源，與傳統的商業淀粉：玉米淀粉、小麥淀粉進行比較，對其理化性質、顆粒大小、形態、結構特性等方面進行了初步研究,為茶葉籽淀粉的綜合開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶葉籽由貴州省畢節市提供；乙醇95%、硫酸、硫酸鉀、硫酸銅、硼酸、甲基紅、溴甲酚綠、鹽酸、硫酸銨、蔗糖、氫氧化鈉、無水碳酸鈣、考馬斯亮藍：均為分析純，廣州試劑化學廠。

1.2 儀器與設備

K9860全自動凱氏定氮儀；XO-5200DTD超聲波清洗儀；HG63水分測定儀； TENSOR27傅里葉變換紅外光譜儀。

1.3 提取工藝流程

茶葉籽→去殼→清洗→去皮→烘干→粉碎→脫脂→粉碎→過80目篩→調整液料比→超聲輔助提取→離心(3 000 r/min，離心10 min)→水洗精制(三次)→離心→干燥(水分<15%)→過80目篩→實驗備用。

1.4 茶葉籽淀粉含量及純度的測定

茶葉籽淀粉含量的測定方法參照GB/T 5009.9—2008《食品中淀粉的測定：第二法酸水解法》測定；茶葉籽淀粉的純度測定方法參照GB/T 20378—2006《原淀粉：淀粉含量的測定：旋光法》測定。計算茶葉籽淀粉提取率：

茶葉籽淀粉提取率/%=m/M×100

式中：M為茶葉籽粉中總的淀粉質量/g；m為提取的茶葉籽淀粉質量/g。

1.5 超聲輔助提取茶葉籽淀粉單因素及響應面實驗設計

1.5.1 超聲時間對茶葉籽淀粉提取率的影響

稱取茶葉籽粉10 g (顆粒度80目)，液料比4∶1(mL/g)、超聲功率120 W、超聲溫度50 ℃條件下，超聲處理10、20、30、40、50 min后，用紗布過濾，濾液經離心后取沉淀，冷凍干燥，計算茶葉籽淀粉提取率。

1.5.2 超聲波功率對茶葉籽淀粉提取率的影響

稱取茶葉籽粉10 g (顆粒度80目)，液料比4∶1(mL/g)、超聲時間30 min、超聲溫度50 ℃條件下，超聲波功率為24、72、120、168、216 W處理后，用紗布過濾，濾液經離心后取沉淀，冷凍干燥，計算茶葉籽淀粉提取率。

1.5.3 液料比對茶葉籽淀粉提取率的影響

稱取茶葉籽粉10 g (顆粒度80目)，液料比為2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1 (mL/g)條件下， 超聲功率120 W、超聲溫度50 ℃、超聲時間30 min處理后，用紗布過濾，濾液經離心后取沉淀，冷凍干燥，計算茶葉籽淀粉提取率。

1.5.4 超聲溫度對茶葉籽淀粉提取率的影響

稱取茶葉籽粉10 g (顆粒度80目)，液料比6∶1 (mL/g)，超聲功率120 W，考察超聲溫度為30、40、50、60、70℃條件下，超聲時間30 min處理后，用紗布過濾，濾液經離心后取沉淀，冷凍干燥，計算茶葉籽淀粉提取率。

1.5.5 響應面優化實驗設計

在單因素實驗基礎上，選出影響較顯著的3個因素：超聲時間、超聲功率和液料比為響應因子，茶葉籽淀粉提取率為響應值，通過中心組合實驗Box-Behnken設計方案[13]，進行3因素3水平實驗分析。

表1 實驗自變量因素與水平

1.6 茶葉籽淀粉理化特性的分析

1.6.1 淀粉溶解度、膨潤力的測定

取一定量絕對干樣品加入適量蒸餾水，于30 ℃條件下邊加熱保溫邊攪拌30 min，防止淀粉沉淀，然后3 000 r/min離心30 min，取上清液在蒸汽浴上蒸干，于105 ℃烘至質量恒定，稱量，計算淀粉溶解度、膨潤力[14]。

溶解度(S)/%=A/m×100

膨潤力(B)/%=P/m(100-S)×100

式中：A為上清液蒸干質量恒定后質量/g；m為絕干樣品質量/g；P為離心后沉淀物質量/g。

1.6.2 淀粉粒度大小的測定

采用激光衍射儀(Mastersizer 2000, Malvern Instruments, Worcestershire, UK)測量淀粉顆粒大小分布。在室溫條件下測量，用去離子水作為淀粉粒的分散劑 (水折射率為1.33)[15]。

1.6.3 淀粉顆粒形態特征的研究

取少量的樣品，涂抹于粘有導電膠布的載物臺上，按壓均勻后，用洗耳球將多余未粘牢的淀粉吹掉。將載物臺置于離子濺射儀中鍍金處理，將處理好的樣品放入掃描電子顯微鏡中觀察并拍攝顆粒形貌，測量顆粒粒徑[16]。

1.6.4 傅里葉變換紅外(FTIR)測定

用Varian 7000 FTIR光譜分析儀對淀粉進行了分析，并采用DTGS檢測器，該檢測器同時配備紅外光譜法全反射率(ATR) ，其含有鍺晶體的光反射設備(45°入射角)(PIKE Technologies, USA)。用相似的方法測定[17]。

2 結果與分析

2.1 茶葉籽組成分結果分析

對茶葉籽原料進行常規的組成分分析，如表2所示，茶葉籽中含有14.78%的油脂，茶皂素質量分數10.22%，總的淀粉質量分數19.87%，可知茶葉籽中含有豐富的淀粉。若將其充分利用，不僅可以提供豐富的代替淀粉資源，而且可為茶葉籽的綜合開發利用提供廣闊的市場前景。

表2 茶葉籽原料的主要組成分分析

2.2 單因素實驗

2.2.1 超聲功率對茶葉籽淀粉提取率的影響

由圖1可知，超聲波功率為24～120 W范圍內，茶葉籽淀粉的提取率隨著超聲功率的增大而逐漸升高，超聲波功率為120 W時，茶葉籽淀粉的提取率達到最大，隨后繼續增大超聲波功率，茶葉籽淀粉的提取率反而呈降低趨勢?？赡苁请S著超聲功率的增大，超聲波的空化作用增強，空化作用可產生瞬時高溫高壓，氣泡在崩潰時產生強烈的機械作用，在液體中引起強大的沖擊波促使高聚物分子在超聲波的作用下產生裂解，當分子鏈的鏈長減小時，高聚物的降解速度也隨著降低，并且在鏈斷裂的地方形成了自由基，這些自由基能和氧或者其他的自由基反應，如果有單體在亦可以引起單體間的聚合反應，生成嵌段或者產生接枝共聚物，從而造成茶葉籽淀粉提取率的降低[18,19]。因此，選擇超聲功率為120 W。

圖1 各單因素對茶葉籽淀粉提取率的影響

2.2.2 超聲時間對茶葉籽淀粉提取率的影響

由圖1可知，超聲時間在10～30 min范圍內，隨著超聲時間的延長，茶葉籽淀粉提取率顯著升高，超聲時間為30 min時，茶葉籽淀粉的提取率達到最大，繼續增加超聲時間，茶葉籽淀粉提取率呈下降趨勢，分析其原因可能是茶葉籽淀粉長時間處于高溫下發生了降解、糊化、縮合等反應。因此，選擇30 min為最佳超聲時間。

2.2.3 液料比對茶葉籽淀粉提取率的影響

由圖1可知，隨著液料比值的增加，茶葉籽淀粉的提取率逐漸增加，液料比為6∶1 (mL/g)時，茶葉籽淀粉的提取率達到最高，隨后隨著液料比繼續增大，茶葉籽淀粉的提取率逐漸下降。提取液的增加，促使茶葉籽粉與提取溶液的充分接觸，有利于茶葉籽淀粉的浸出。但液料比值達到6∶1(mL/g)時，茶葉籽淀粉的浸出基本達到飽和。當溶劑量繼續增加，溶液離心次數增多，導致一部分茶葉籽淀粉混合在離心液中流失，從而影響茶葉籽淀粉的提取率。綜合考慮，故選取液料比為6∶1(mL/g)。

2.2.4 超聲溫度對茶葉籽淀粉提取率的影響

由圖1可知，超聲溫度在30～50 ℃范圍內，隨著超聲溫度的升高，茶葉籽淀粉的提取率隨之增加，超聲溫度增加到60 ℃時，茶葉籽淀粉提取率達到最高，繼續增加超聲溫度，茶葉籽淀粉的提取率上升較緩慢，隨后趨于穩定。淀粉屬于多羥基化合物，提高超聲溫度有利于淀粉浸出，但溫度過高則會影響淀粉的穩定性，促使淀粉糊化，引起茶葉籽粉顆粒間蓬松性變得致密，部分淀粉被夾裹于致密的茶葉籽顆粒中，不利于淀粉浸出[20]。在不破壞茶葉籽淀粉質構的基礎上，綜合考慮，故選取最佳超聲溫度為50 ℃。

2.3 茶葉籽淀粉提取工藝回歸模型的建立及方差分析

在超聲波輔助提取茶葉籽淀粉工藝中，選擇影響較為顯著的因素：超聲波功率(A)、超聲時間(B)、液料比(C)為實驗優化自變量，以茶葉籽淀粉提取率(Y)為響應值，采用Design-Expert軟件對表3、表4中實驗結果進行響應曲面分析，得到回歸方程：

Y=97.88+2.69A+0.82B+3.93C+2.42AB-1.77AC-1.25BC-3.29A2-4.05B2-7.42C2

表3 超聲波輔助提取茶葉籽淀粉工藝響應面實驗結果與分析

表4 各因素和回歸方程的方差分析

注：*差異顯著P<0.05；**差異較顯著P<0.01；***差異極顯著P<0.001；R2=0.996 8；R2=0.992 8。

根據實驗結果進行方差分析，從表4可知，該模型中F值為245.34，P<0.000 1，達到極顯著水平。失擬項差異不顯著(P=0.053 9>0.05)，表明該回歸方程對試驗擬合程度較好。

對回歸方程的顯著性進行檢驗分析，表明超聲波輔助提取茶葉籽淀粉工藝條件中超聲功率A、超聲時間B、液料比C及二次項A2、B2、C2分別對茶葉籽淀粉的提取率影響極顯著；交互項AC、AB、BC分別對茶葉籽淀粉的提取率影響較顯著(P<0.01)。結果表明，模型回歸系數R2=0.996 8，校正決定系數R2=0.992 8。 因此使用此模型對超聲波輔助提取茶葉籽淀粉提取率的分析和預測是可靠的。

2.4 響應面分析與及優化

根據回歸方程，考察交互項對茶葉籽淀粉提取率的影響，經Design-Expert軟件分析所得等高線圖，如圖2所示。

由表4可知，響應面值開始隨著各因素的增加而增加，達到最高點后，響應面值逐漸呈降低趨勢。等高線圖可直觀地反應各因素對茶葉籽淀粉提取率的交互作用程度，等高線呈圓形表示兩因素交互作用不顯著，等高線呈橢圓形或馬鞍形則表示兩因素交互作用顯著[21]。由圖2中可以看出，超聲功率A、超聲時間B、液料比C的等高線圖呈明顯的橢圓形，表明兩因素交互作用明顯。

2.5 驗證實驗

為了確定響應面法所得結果的可靠性，利用 Design-Expert 軟件進行分析，得到最佳茶葉籽淀粉提取率的工藝條件：超聲功率120 W；超聲時間30 min；液料比6∶1(mL/g)，在此工藝條件下茶葉籽淀粉的提取率高達98.28%。在此優化條件下進行3次平行試驗，實際結果表明茶葉籽淀粉的提取率為 98.12%，實際值與理論值較為接近。表明該回歸模型能夠很好地反映各因素對茶葉籽淀粉的提取率的影響，并證明了使用該方法研究超聲波輔助提取茶葉籽淀粉工藝的可行性。

2.6 茶葉籽淀粉理化指標的分析

由表3可知，不同來源的淀粉，其化學組成分及產品性質具有一定的差異。目前淀粉行業一般以產品的純度、蛋白含量、脂肪含量、灰分、直鏈淀粉含量、支鏈淀粉含量、水分等理化指標衡量淀粉質量的優劣。由結果可知茶葉籽淀粉符合國家相關標準。

2.7 淀粉顆粒大小與SEM形態分析

如圖3和表6所示，茶葉籽淀粉的粒徑分布與玉米淀粉、小麥淀粉的粒徑分布進行了比較，結果表明，茶葉籽淀粉的粒度分布中值最小(1 718 nm)。原因可能是由于超聲波的氣室效應對茶葉籽淀粉顆粒產生切削作用，使其細胞破碎，降低了茶葉籽淀粉的分子質量，導致其淀粉粒度分布中值減小[22]。圖4中掃描電鏡(SEM)圖像表示，茶葉籽淀粉顆粒形態程規則的球形；玉米淀粉粒度中值最大 (5 125 nm)，顆粒形態程多角形，這可能與玉米淀粉顆粒多呈雙模態分布有關，大部分淀粉粒子聚集在一起，從而導致其粒度中值偏大；小麥淀粉顆粒形態大部分呈不規則橢圓形，小的呈圓形。不同來源淀粉顆粒形態各不相同，原因可能與不同淀粉顆粒包裹薄壁組織細胞的緊密度有關[23]。

圖2超聲功率、超聲時間和液料比對茶葉籽淀粉提取率影響的等高線圖

表5 茶葉籽淀粉與玉米淀粉、小麥淀粉理化指標

圖3 茶葉籽淀粉、玉米淀粉、小麥淀粉粒徑大小的分布

圖4 從左至右茶葉籽淀粉、玉米淀粉和小麥淀粉的SEM圖×1 000倍

表6 茶葉籽、玉米和小麥淀粉顆粒大小、溶解度、膨脹力

樣品顆粒大小/nm溶解度/%膨脹力/%茶葉籽1 718±0.0122.19±0.0340.75±0.01玉米5 125±0.0212.28±0.0116.05±0.09小麥5 022±0.0524.7±0.0311.87±0.02

淀粉膨脹力的大小體現了淀粉水結合能力的高低，反映淀粉粒子間化學鍵結合類型及結合程度。表6中表明，茶葉籽淀粉的溶解度為22.19%遠大于玉米淀粉的溶解度；茶葉籽淀粉溶脹力最大為40.75%。可能是由于超聲波對茶葉籽淀粉細胞的破碎及分散作用，從而降低淀粉顆粒間化學鍵的結合程度，導致其膨潤力升高[24]。

2.8 紅外光譜分析

為了進一步更好的分析茶葉籽淀粉的結構特征，對茶葉籽淀粉與玉米淀粉、小麥淀粉做了紅外光譜對比試驗分析。

圖5 茶葉籽淀粉與小麥淀粉、玉米淀粉紅外光譜圖

3 結論

超聲波輔助提取茶葉籽淀粉，在單因素試驗基礎上利用響應面優化試驗進行分析，確定最佳的提取工藝：超聲功率120 W；超聲溫度50 ℃；超聲時間 30 min；液料比6∶1(mL/g)，在此工藝條件下茶葉籽淀粉的提取率達到98.28%，比傳統的水提法提高了16.35%。

茶葉籽淀粉純度為84.52%，蛋白質質量分數為0.54%，脂肪為0.34%，灰分為0.17%；顆粒大小為1 718 nm，溶解度22.19%，膨脹力40.75%；通過SEM圖像可知茶葉籽淀粉顆粒形狀呈規則的球形；紅外光譜分析得到茶葉籽淀粉處于締合狀態的氫鍵較多。本試驗結果為茶葉籽淀粉的進一步分離純化和理化特性、形態結構的分析提供了參考。