基于X射線斷層掃描的小麥籽粒霉變結構研究

周 穎 惠延波 馮蘭芳 閆 磊 馬曉曉

(河南工業大學，鄭州 450001 )

小麥在儲藏期間，外界的高溫高濕空氣或糧堆濕熱擴散量超過籽粒水分平衡速度時，特別容易被霉菌和真菌降解，被霉菌真菌病原體感染的核會導致干物質含量和核密度的降低，在糧倉中經常會出現結頂、掛壁、點翠等現象。霉菌是糧食儲藏期危害嚴重的微生物類群，霉菌的次級代謝物會引起糧食品質的劣變和真菌毒素的產生。據統計，糧食生產因霉菌活動導致的損失率約占糧食總產量的3%以上，霉菌在造成經濟損失的同時也給食品安全帶來了嚴重的不確定性[1,2]。掌握糧食中霉菌生長代謝規律，及早的發現霉菌，對確保儲糧安全意義重大。

小麥籽粒最外層有一層堅硬的組織叫種皮，它包圍著胚乳和胚芽， 因此在不破壞內核、無損的情況下來研究霉菌污染對內部籽粒結構的影響是非常困難的。常規的“平皿菌落計數法”、基于細胞中酶活性變化的“微生物活性檢測方法”主要局限于檢測糧粒外部霉菌量的變化[3-5]，基于微生物生長代謝活動導致溫度和呼吸強度變化的“電子測溫”和“二氧化碳檢測”的方法是間接的，通常是在糧倉或大型糧堆中檢測，但其監測霉菌生長活動的起點較實際滯后[6-9]。微生物的生理活動不僅會消耗糧食中的成分，而且會破壞糧食的組織、結構，目前對小麥籽粒本身感染霉菌后內部結構的變化研究較少。傳統的圖像分析技術如光學顯微鏡(LM)、掃描電子顯微鏡(SEM)、激光掃描共聚焦顯微鏡(CSLM)、聚離子束掃描電子顯微鏡(FIB-SEM)、原子粒顯微鏡(AFM)等。這些圖像分析技術在樣件制備的過程中需要對樣件進行切片和化學處理, 耗時、危害健康、污染環境，對制備的切片進行分析時僅能夠得到樣件內部的結構信息,不能給出整個籽粒內部三維內核的各向異性信息,而且樣件可能經過切片和化學處理后會破壞原始結構并引入成像偽影。

X射線顯微計算機斷層掃描技術是一種非破壞性的三維成像和分析技術，用于無損分析各種材料的內部結構特征或用于材料內部缺陷的檢測，最近作為食品科學領域一種較為新穎的方法，已被成功地應用于獲取不同理化條件下食品的微觀結構信息[10-13]。Gubatz等[14]利用連續切片重建發育的大麥籽粒的數字模型，該模型提供了在開花期，胚乳發育合胞期和淀粉積累開始時發育谷物的詳細空間描述。Schulze等[15-17]利用X射線分析了真空浸漬槲皮素衍生物對蘋果薄壁組織強化的影響及蘋果果核內孔隙結構及分布。Zhu等[18]通過X射線顯微CT研究高直鏈淀粉和野生型水稻的籽粒結構，實現了內核結構的三維表征。Orina等[19]利用X射線顯微CT無損的分析感染輪狀鐮刀菌的玉米籽粒的內部結構。X射線提供了獲取完整三維結構圖像手段，以非破壞性方式在微觀層面上展示可視化內部結構，對圖像進行分析處理還可以實現內部結構數據的量化。因此，該技術不僅用于內部特征的定性描述，而且還可用于定量分析。

X射線三維顯微鏡是采用傳統CT技術與光學顯微技術結合，X射線斷層掃描是一種無創傷和無損成像技術，可用于高分辨率的三維可視化和表征。X射線源發射出來的射線束，在穿過待測樣本時與待測樣本發生作用，由于樣本內的密度和成分差異，待測對象的不同部位對X射線的吸收率不同造成X射線的衰減，樣本內的X射線衰減的變化產生不同的圖像對比度。用X射線三維顯微測試系統，將樣本旋轉得到一系列不同灰度的二維X切片，這一系列切片，覆蓋整個樣本，可以被渲染成一個三維的圖像，可以在不同的深度和不同方向作為一個整體或虛擬切片如圖3所示。本研究的目的是確定X射線顯微CT是否是研究小麥籽粒霉變后內部微觀結構變化的有效手段，通過對二維截面圖分析霉變后籽粒內部結構的變化與不同，通過對圖像進行重建和渲染，實現對感染籽粒及內部孔隙的三維可視化，除了可視化還可以獲取籽粒體積、籽粒內部孔隙率等參數。為進一步探討糧食內部的孔隙與糧情之間的關系提供參考。

1 材料與方法

圖1詳細介紹了用X射線斷層掃描方法無損研究霉變對小麥籽粒三維結構的影響的實驗流程圖。

圖1 用X射線顯微CT分析發霉對籽粒微觀結構影響的流程圖

1.1 實驗材料

實驗材料選用小麥品種為周麥26，由河南工業大學實驗田提供，隨機取部分實驗籽粒

〗利用ASAE S352標準把小麥籽粒在130 ℃條件下烘干19 h，通過測量烘干前后水分的損失測得的初始含水率為12%。小麥中按NYT1094.1—2006標準中規定潤麥加水量公式(1)計算潤麥加水量，加入一定量的無菌水，均勻混合，然后置于5 ℃以下的冷藏箱中存放48 h，調制后實驗樣品的初始含水量26%。

(1)

1.2 發霉樣件

2種發霉的樣件如圖2所示，圖2a為常溫條件下發霉的樣件：將調制后含水量為26%的小麥裝入1 000 mL的廣口瓶中，用保濕劑(含氯化鈉8%，甘油10%)浸泡過的棉紗布將瓶口覆蓋8層，放在常溫下；圖2b為恒溫恒濕箱中模擬儲藏條件的發霉樣件：將調制后含水量為26%的小麥裝入1 000 mL廣口瓶中，用保濕劑(含氯化鈉8%，甘油10%)浸泡過的棉紗布將瓶口覆蓋8層，置于德國BINDER恒溫恒濕培養箱，調整培養箱的溫度為28 ℃，將濕度調節至接近小麥平衡水分的范圍，保持小麥水分在整個實驗周期中基本穩定。在本實驗條件下小麥的含水量變化不超過0.5%。7 d后各取6粒樣件放置X射線微米CT執行掃描。

圖2 小麥籽粒感染霉菌圖

1.3 實驗方法

用Y.CHEETAN型微米X射線斷層CT進行掃描，設置工作參數：電壓70 kV，電流40 μA,測量分辨率為7.14 μm。 測試時首先將小麥籽粒用泡沫塊固定，注意在固定時盡量避開小麥籽粒發霉的部位。再用雙面膠將固定好小麥籽粒的泡沫塊粘接在旋轉柱上，粘接牢固后放置旋轉臺，在旋轉臺上保持射線源和探測器不動；旋轉臺旋轉1個小角度，探測器采集1組數據，直至旋轉臺轉360°，完成1次圓周的掃描，掃描時不需要人工協助機器完全自動化操作，掃描大概需要20 min，掃描完成獲取1024張二維切片。

圖3 X射線的三維視圖及對應的二維截面視圖

2 圖像處理與重構

從Y.CHEETAH X射線CT中采集從不同角度對小麥籽粒的投影成像圖，需要對其進行重建才能得到小麥籽粒的三維結構。在Image J軟件中實現了對1 024張切片的重構可視化與定量分析。應用了非局部均值濾波算法對圖像采集過程中由于人為、設備等各方面的原因攜帶的各種噪聲信號進行去除，在去除噪聲的同時，最大限度的保持圖像輪廓，紋理等細節特征。同時又使用了交互式閾值分割算法將樣品信息與背景信息，樣品內部不同特征區域劃分出來。通過渲染對重建后的模型進行三維可視化，渲染是觀察和可視化內部形態和微觀結構所必需的，通過渲染對不同組織結構賦予不同的顏色，把不同的組織結構從整體中剝離出來，得到籽粒的三維形態信息及樣品局部細節信息，可以直觀形象地觀察籽粒的三維形貌。

3 參數計算

通過X射線顯微CT再附加相關的重建算法，可以實現對小麥籽粒內部孔隙結構的重建表征，獲取如籽粒體積、孔隙體積、孔隙大小分布、孔隙率等參數。重構切片上的每個像素代表了體積圖像中的一個立方體體素，經過閾值分割后的三維數據每個組織結構所占的體素數量都是已知的，目標體積可以通過公式(2)獲取。

V=S×N

(2)

式中：S為每個體素體積；N為體素的個數。

孔隙率是孔隙空間的體積與樣品總體積的比率,如公式(3)，以百分比表示。

(3)

式中：P為孔隙率；V1為空氣體積；V2為籽粒體積。

4 結果分析與討論

X射線顯微CT基于圖像對比度，該圖像對比度由樣本內的X射線衰減的變化產生，X射線衰減的變化可歸因于樣本內的密度和成分差異。使用閾值分割程序從背景中分割籽粒可以得到籽粒的灰度直方圖如圖4所示，灰度值范圍從0到655 35之間，灰度值與圖像對比度有關，如果灰度值集中在圖像的下端，圖像的亮度比較暗，相反灰度值集中在上端圖像就會比較亮。整個核灰度直方圖的不同峰值對應了不同的相位，低灰度值對應于內部的空氣，高灰度值對應于核結構。發霉后籽粒灰度值的頻率在0～10 000范圍內有升高的趨勢，說明空氣相增多，孔隙增加。

圖4 小麥籽粒的灰度直方圖

4.1 霉菌生長部位分析

小麥籽粒的解剖結構有種皮，胚乳，胚，盾片組成，它們具有不同的化學成分，這些解剖結構在微生物生長代謝的作用下組織會發生變化，X射線顯微CT能夠根據它們在X射線衰減方面的差異將這些結構組件在內核中區分開來。

圖5展示了不同條件下小麥籽粒水平視圖和矢狀圖。從二維截面圖上可以看出小麥籽粒感染霉菌初期，霉菌生長代謝首先出現在小麥籽粒的胚部，胚部豐富的營養為霉菌的生長代謝提供了適宜的基質，霉菌初期在小麥籽粒上生長呈現向外繁衍的趨勢。糧粒種皮的保護作用也是影響霉菌生長活動的重要因素[20]，胚部外圍的皮層組織較其他部位皮層組織薄，對胚組織的保護弱，且皮層與胚之間存在著較大的孔隙，微生物生長所需環境條件主要有碳源物質、氧氣、水和無機鹽，皮層與胚之間的空隙為微生物的有氧呼吸提供了良好的空間。圖5a為未感染霉菌的小麥籽粒的二維截面(水平、矢狀)圖，小麥皮層輪廓線清晰，胚組織緊密，吸收X射線的能力較強，圖像灰度值高更亮。圖5b為常溫下發霉小麥籽粒的二維截面(水平、矢狀)圖，霉菌感染初期菌絲及孢子數量少，對X射線的吸收較少，圖像灰度值低，亮度低。圖5c模擬儲藏環境下感染霉菌小麥籽粒的二維截面(水平、矢狀)圖，皮層的輪廓線較模糊，且胚部的圖像的灰度值也較其他未感染籽粒低，主要儲糧微生物含有多種酶類，它們可以通過呼吸作用，分解糧粒中蛋白質、淀粉、碳水化合物、糖類、纖維素、有機酸等有機物質，為其生長﹑繁殖﹑代謝所利用，導致內核的降解，胚組織密度降低[21]，吸收X射線的能力減弱，圖像灰度值低，亮度變低。

圖5 不同條件下感染霉菌的小麥籽粒的二維橫截面圖

4.2 發霉部位的三維可視化圖

分割渲染重構后的小麥籽粒如圖6所示。圖6a為未霉變的籽粒，圖6b為常溫下發霉的籽粒，圖6c為培養箱中模擬儲藏條件感染霉菌的籽粒。圖中紅色部分為小麥籽粒的胚部，藍色為胚乳部分，黃色為種皮部分，暗綠色為霉菌生長部位。從重構視圖發現種皮與胚乳及胚部并不是緊密的貼合在一起，中間存在孔隙，種皮呈褶皺狀覆蓋在胚乳及胚組織的表面，小麥籽粒的背部的種皮褶皺多。小麥籽粒在常規自然條件下霉菌的生長代謝主要在胚部，在培養箱中霉菌的生長代謝主要集中在胚部，腹溝靠近果毛處也存在部分霉菌。

注：紅色為胚，藍色為胚乳，淡黃色為種皮，暗綠色為霉菌。圖6 重構完成后小麥籽粒的三維視圖

4.3 定量參數計算

籽粒內部的孔隙中游離的氧原子是碳水化合物、脂類和蛋白質等有機化合物主要組成成分，它在微生物細胞的結構和酶的功能方面起著重要的作用，對絕大多數微生物的生長代謝而言絕對是必要的。由于霉變導致小麥籽粒體積、內部孔隙度的變化和額外孔隙度的發展是有可能的，對霉變后小麥籽粒孔隙的表征與研究對于探究霉菌與孔隙之間的關系及霉菌內部生長代謝機理意義重大。體積的測定常采用液體置換法，孔隙的測定需要先測定容重、體積等參數在通過公式間接進行計算這些方法不能實現單個籽粒體積的計算，更不能實現籽粒內部孔隙的三維可視化。X射線斷層掃描方法不僅可以獲取一定量籽粒的體積、孔隙率，而且可以實現單個籽粒體積，內部孔隙的表征和定量計算。利用X射線首次實現了不同條件下小麥籽粒霉變后內部孔隙的三維可視化如圖7。

圖7 小麥籽粒的孔隙圖不同顏色代表不同孔隙大小(培養箱發霉后)

獲取了籽粒體積、孔隙體積及孔隙占籽粒總體積的比例等參數如表1。從這些視圖中可以看出孔隙的大小、位置、分布等，孔隙多數集中在小麥籽粒腹溝內側的種皮附近。培養箱里發霉籽粒的孔隙率要大于自然條件發霉的籽粒，這些參數將對研究孔隙與霉菌之間的關系提供良好的前提。

表1 小麥顆粒的幾何參數

5 結論

研究表明高分辨率X射線顯微CT是研究小麥籽粒感染霉菌后內部結構變化的一種有效的手段，通過對比不同狀態下小麥籽粒的灰度值可以區分籽粒是否感染霉菌，通過X射線的二維截面視圖發現盾片和種皮是小麥籽粒內部的致密區域，灰度值大、亮度高。胚組織外圍的種皮較其它部位薄，對胚的保護力度較弱，小麥籽粒在感染霉菌后最先侵入的部位是胚部。小麥籽粒在模擬儲藏條件下感染霉菌后，胚部營養物質被霉菌的生長代謝消耗導致核內干物質的分解，核密度的降低，吸收X射線的能力低，灰度值變低。根據X射線衰減方面的差異實現小麥籽粒內部結構及孔隙的三維可視化表征，統計并計算了小麥籽粒的體積、孔隙體積、孔隙率等參數。這些可以用于糧食籽粒儲藏期間易發霉部位如(糧倉墻壁附近、糧粒表層)以及糧食在深加工前是否霉變的區分檢測，也可以用于無損檢測單顆小麥籽粒被生物材料損傷后微觀結構組織的變化。通過對籽粒霉變形態結構做的基礎性研究和參數的大量統計分析，有可能為后續無損檢測儀器和快速檢測儀器的開發提供參考。