DHA藻油脂質體制備及性質的研究

黃 茜 王淑慧 崔 婧 毛苗苗 徐 健 胡詩慧 慕鴻雁

(青島農業大學食品科學與工程學院，青島 266000)

隨著生活水平的提高，人們對于功能性多不飽和脂肪酸的關注度大大提高，其中富含DHA的魚油、藻油是市場關注熱點。DHA是人體大腦和視網膜的重要組成部分，對嬰幼兒的智力和視力發育具有重要作用[1]；在炎癥控制、心血管疾病的調控、機體免疫力增強等方面發揮積極的功效[2-4]。市面上的DHA產品多來自于魚油，魚油中脂肪酸組成復雜，DHA含量相對不高，且其應用因海水污染、過度捕撈而受限。天然微藻是海生魚的食物，脂肪酸組成較簡單，是魚油中多不飽和脂肪酸的主要來源。我國國家衛生部于2010年將裂壺藻油列為新資源食品，其DHA質量分數約為40%，可添加于嬰幼兒配方奶粉，亦可作為多不飽和脂肪酸營養補充劑。但藻油含有大量C=C雙鍵，導致其性質不穩定，極易發生氧化酸敗，影響感官品質和營養價值降低，甚至產生對人體健康有潛在危害組分。因此，提出切實可行的提高藻油氧化穩定性的解決方案，尤為必要。脂質體是由磷脂等雙親性物質組成的雙分子層閉合囊泡，可實現對功能性成分的包封和運載，有效發揮其緩控釋作用[5]；此外磷脂雙分子層的保護作用，還可有效提高功能成分的穩定性[6]。研究表明以脂質體形式存在的魚油氧化穩定性顯著提高，將其作為食品基料添加于食品，具有較高的儲存穩定性[7-8]，但是關于藻油脂質體的制備及應用研究還很少?；谝陨详U述，本研究以大豆卵磷脂、膽固醇、DHA藻油、吐溫-80為原料，采用薄膜超聲法制備DHA藻油脂質體，通過單因素試驗，以包封率、平均粒徑為指標探討最佳制備條件，通過紅外吸收光譜分析研究其氧化穩定性，并對其體外消化進行模擬，以期為功能性多不飽和脂肪酸的穩定化技術提供借鑒，也為藻油的應用研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

DHA藻油，大豆卵磷脂(純度≥97%)，膽固醇(≥95%)，豬胰脂酶，牛血清蛋白，膽酸鈉，吐溫-80；無水乙醇、石油醚、脲素、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等，均為分析純。

1.2 儀器與設備

TU-1810DASPC紫外可見光光度計；ZEN-3690Malvern納米激光粒度分析儀；SCIENTZ-10N冷凍干燥機；Neofuge15高速離心機；NICOLET iS10傅里葉變換紅外光譜儀；JEM-2100高分辨率透射電子顯微鏡。

1.3 實驗方法

1.3.1 脂質體的制備[9]

采用薄膜分散法，稱取一定量的大豆卵磷脂、膽固醇、DHA藻油和吐溫-80，按一定比例加入無水乙醇中超聲混勻，于一定溫度旋轉蒸發脫溶并均勻成膜；再加入定量磷酸鹽PBS緩沖液，經水化洗膜得到粗脂質體，將其置于冰水浴中超聲一定時間得到均勻分散的脂質體澄清液。

1.3.2 單因素實驗

分別考察原料配比(大豆卵磷脂/膽固醇質量比、大豆卵磷脂/DHA藻油質量比)、制備因素(蒸脫溫度、pH、超聲時間和超聲功率)對DHA藻油脂質體包封率及性質的影響。

1.3.3 包封率的測定1.3.3.1 標準曲線繪制

(1)DHA藻油溶解于石油醚中，配成濃度為0.6 mg/mL的溶液，以石油醚為空白對照，在190～400 nm波長范圍內進行掃描，得到溶液的吸收波長掃描曲線；將大豆卵磷脂和膽固醇做相同處理。

(2)配制一系列不同濃度(0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL)的DHA藻油-石油醚溶液，以石油醚為空白，在最佳波長處測定DHA藻油-石油醚溶液的吸光度，以DHA藻油的濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.3.2 包封率

取適量DHA藻油脂質體溶液于4 200 g離心10 min，得到上清液，取4 mL上清加入20 mL石油醚提取，靜置，然后在最佳波長處測定其吸光度，根據如下公式計算包封率：

包封率(EE)=(混懸液中油的總重量-未包封的油)/總的藻油重量×100%

1.3.4 粒徑、電位

取適量DHA藻油脂質體，加入蒸餾水稀釋到合適濃度，采用納米激光粒度分析儀測定其平均粒徑大小和Zeta電位，平行測定3次并取平均值。

1.3.5 微觀形貌

將藻油脂質體樣品加水稀釋至10 mg/mL，將銅網浸入樣品溶液，濾紙吸干多余液體，冷凍干燥，在透射電鏡下觀察藻油納米脂質體的形態。

1.3.6 紅外吸收光譜

將凍干后的藻油脂質體以無水乙醇復溶，取適量純溴化鉀粉末在瑪瑙研缽中研磨均勻，壓制成空白KBr片，取一滴樣品溶液滴于空白KBr片上，在紅外燈下烘干后上機測定。

1.3.7 體外模擬消化[9]

腸液消化液(pH 7.4)：取9.07 g KH2PO4，0.007 5 g脲素，1 g牛血清蛋白，0.375 g豬胰脂酶，1.5 g膽酸鈉用0.2 N氫氧化鈉調節pH至7.4[9]。

消化反應：將脂質體樣品與模擬腸液溶液以1∶3的體積比混合，在37 ℃水浴恒溫振蕩器中混勻預熱。豬胰脂酶以相應的腸液溶解，反應開始時間為加入酶的瞬間。在1、5、20、120 min時分別取樣于95 ℃的恒溫水浴鍋中加熱2 min滅酶，測定其平均粒徑。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

DHA藻油、大豆卵磷脂、膽固醇石油醚溶液的吸收波長如圖1所示，藻油的最大吸收峰出現在240 nm處，大豆卵磷脂和膽固醇最大吸收峰也出現在此處，而藻油在274 nm處有一個突出的吸收峰。因此，將274 nm選作測定藻油脂質體包封率的最佳吸收波長。根據在274 nm波長處所測得的數據，以藻油-石油醚溶液濃度為橫坐標吸光度為縱坐標，得到藻油-石油醚溶液標準曲線，如圖2所示，其線性回歸方程為y=0.611 9x+0.008 6，R2=0.999 3。

圖1 DHA藻油、大豆卵磷脂、膽固醇石油醚溶液的吸收波長

圖2 DHA藻油-石油醚溶液標準曲線

2.2 單因素結果分析

2.2.1 原料配比對DHA藻油脂質體包封率和性質的影響

以脂質體的包封率、粒徑和電位為考察指標，在其他因素(溫度40 ℃、pH 7.2、超聲功率350 W、超聲時間60 s)不變情況下分別探討了大豆卵磷脂/DHA藻油質量比、卵磷脂/膽固醇質量比對脂質體包封率及性質的影響，結果如圖3、圖4所示。

圖3 物料比對脂質體包封率的影響

a

b圖4 物料比對脂質體粒徑、電位、PDI的影響

由圖3可知，隨著大豆卵磷脂/膽固醇質量比的提高，DHA藻油脂質體的包封率逐漸增加，在兩者質量比為3∶1時最大，之后呈降低趨勢。這是由于膽固醇會改變大豆卵磷脂的相變溫度，影響磷脂雙分子層的流動性。適量的膽固醇會降低磷脂雙分子層的流動性，使脂質體膜的致密性增加，從而提高包埋率[10]。保持大豆卵磷脂/膽固醇質量比為3∶1，考察大豆卵磷脂與DHA藻油質量比對脂質體包封率的影響，發現包封率變化顯著。當大豆卵磷脂/DHA藻油質量比為2∶1時，脂質體包封率僅為(70.05±0.54)%；隨著卵磷脂比例升高，包封率逐漸增加，當卵磷脂/DHA藻油比為5∶1時，包封率達到(88.46±0.87)%，之后繼續增加卵磷脂含量，包封率變化不明顯。在整個原料配比考查范圍內，脂質體粒徑為200～600 nm，說明所制備的脂質體為納米脂質體。電位是考察脂質體顆粒穩定性的重要參考指標，顆粒間靜電斥力越大，脂質體顆粒越不容易發生聚集等現象[11]。在整個物料比考察范圍內，所得脂質體的電位絕對值均高于30 mV，說明該條件下所制備的脂質體具有較好的穩定性。當卵磷脂/膽固醇質量比為3∶1，卵磷脂/DHA藻油質量比為5∶1時，所制備的納米脂質體粒徑為(247.1±0.3)nm， PDI為0.279±0.003，說明脂質體粒徑分布均勻。故確定大豆卵磷脂/膽固醇質量比為3∶1、大豆卵磷脂/藻油質量比為5∶1。

2.2.2 制備因素對藻油脂質體包封率和性質的影響

保持大豆卵磷脂/膽固醇質量比為3∶1，卵磷脂/藻油質量比為5∶1，分別探討了蒸脫溫度、pH、超聲時間和超聲功率對納米脂質體包封率和粒徑、PDI、電位的變化，結果如圖5、圖6。

圖5 制備條件對脂質體包封率的影響

由圖5可知，溫度、pH和超聲功率對脂質體包封率具有重要的影響，在實驗溫度范圍內，脂質體的包封率先增加后降低，實驗過程中發現溫度過低會導致脂質體成膜時間長且不均勻，溫度過高則會增加DHA藻油的氧化損失。蒸脫溫度為40 ℃時，脂質體的包封率最高。脂質體的外被膜為磷脂雙分子層，因此酸性條件下會加速脂質體的水解[10]，在實驗范圍內，脂質體的包封率隨著pH增加而增加，當溶液pH為7.4時，脂質體包封率相比于其他pH值脂質體包封率較高。適度的超聲有利于脂質體的分散，而長時間超聲，可影響脂質體囊泡的結構，且超聲會產生熱量，時間越長，產生的熱量越多，會影響到磷脂雙分子層的穩定性，當超聲時間為120 s時脂質體的包封率最高。DHA藻油脂質體的包封率隨著超聲功率的增加呈現先增大后減小的變化，這是由于過高的超聲功率會破壞脂質體囊泡結構，使DHA藻油從脂質體中滲漏，從而使包封率降低，當超聲功率為350 W時，包封率顯著高于其他功率下的結果。

圖6 制備條件對脂質體粒徑、PDI和電位的影響

圖6是各制備條件下脂質體的粒徑、電位及PDI。由圖6可知，各制備因素對所得脂質體的粒徑、PDI和電位均有重要的影響，但在實驗范圍內，所制得的脂質體粒徑均小于600 nm，電位絕對值為25～48 mV。當蒸脫溫度為40 ℃、pH7.4、350 W超聲120 s時所制備的脂質體包封率最高，為(91.55±0.4)%，粒徑為(224.5±0.21)nm，PDI為0.224±0.003，電位(-32.4±0.03)mV，說明所制備的納米脂質體粒徑分布均勻且穩定。

所得藻油脂質體的最佳制備條件為：大豆卵磷脂與膽固醇比為3∶1(g/g)、大豆卵磷脂與DHA藻油比為5∶1(g/g)、蒸脫溫度為40 ℃、pH為7.4、超聲時間為120 s、超聲功率為350 W。

2.2.3 透射電鏡結果分析

DHA藻油脂質體的透射電鏡圖如圖7所示。由圖7可見，脂質體呈現球形或橢圓形，粒徑均在納米級，這與激光粒度分析儀所測得的結果一致；最佳條件下的脂質體邊緣基本沒有油脂，說明最佳條件下脂質體對DHA藻油的包封效果明顯。

圖7 藻油脂質體的透射電鏡圖

2.2.4 紅外吸收光譜分析

注：圖中曲線從上到下依次為脂質體，DHA藻油，膽固醇，卵磷脂。a

注：圖中曲線從上到下依次為室溫放置1周的DHA藻油，DHA藻油，室溫放置1周的脂質體，脂質體。b圖8 大豆卵磷脂、膽固醇、DHA藻油、脂質體的紅外光譜

2.2.5 體外模擬消化結果分析

研究表明，脂質在體內的消化與脂肪酶的活性有關，而低pH對脂質體的影響很小[13]。本實驗在預實驗中也得到了一致的結果。由于脂肪酶、磷脂酶主要分布在小腸中，本研究重點探究了脂質體在腸液中的粒徑的變化，結果如圖9所示。

藻油脂質體在模擬腸液溶液中平均粒徑呈先逐漸增加而后減小的趨勢。本實驗中所用的胰脂酶是從豬體內提取得到的，含有脂解酶(包括脂肪酶、磷脂酶A2和膽固醇酶)，這三種脂解酶均對磷脂產生作用，其中，磷脂酶A2對磷脂雙分子層結構具有較強的破壞能力。經脂解酶的作用，DHA藻油脂質體的結構可能發生變化，導致脂質體的絮凝，從而使平均粒徑增大。隨著脂質體被消化，其平均粒徑隨之減小，這是由于腸液中膽酸鈉的存在，破壞了脂質體的雙分子層膜，脂質體被消化吸收，使平均粒徑減小[14]。

圖9 不同消化時間脂質體的粒徑

3 結論

本研究以包封率、平均粒徑為指標，通過單因素試驗確定了制備DHA藻油脂質體的最佳條件:大豆卵磷脂與膽固醇質量比為3∶1(g/g)、大豆卵磷脂與DHA藻油質量比為5∶1(g/g)、溫度為40 ℃、pH為7.4、超聲時間為120 s、超聲功率為350 W。在此條件下，脂質體包封率可達(91.55±0.4)%，粒徑為(224.5±0.21)nm，PDI為0.224±0.003，電位(-32.4±0.03) mV，形貌為橢圓球形。通過紅外吸收光譜圖發現，DHA藻油脂質體對DHA藻油的包封效果良好，室溫放置數天后的DHA藻油脂質體紅外光譜圖無明顯變化，DHA藻油脂質體的穩定性遠高于DHA藻油。