山茶油脫臭餾出物中角鯊烯的分離純化及對豬油抗氧化作用的研究

葉虔臻 王 微 董柳青 周琛媛 沈建福

(浙江大學生物系統工程與食品科學學院1,杭州 310058)(桐廬縣檢驗檢測中心2，杭州 311500)(浙江經貿職業技術學院3，杭州 310018)

角鯊烯(Squalene)是由6 個異戊二烯連接而成的不飽和三萜類化合物，常溫下呈油狀，有輕微令人愉悅的氣味，具有抗氧化、抗輻射、調控膽固醇代謝、抑制微生物生長等功效，被廣泛用于化妝品、醫藥和食品工業等領域的開發中[1]。角鯊烯來源廣泛，存在于鯊魚肝臟、植物種籽，以及某些微生物、微藻和人體皮脂中。而目前天然角鯊烯提取主要以植物，如油橄欖、雞矢藤、紅棗等，或植物油及其加工副產物，如皂腳、脫臭餾出物及冬化物等中分離得到[2]。也有研究表明采用工程菌株可大幅提高角鯊烯的制備[3]。

脫臭餾出物是油脂在脫臭環節得到的副產物，含有多種生物活性成分，如天然VE、植物甾醇、角鯊烯等[4]。據李志曉等[5]對油茶籽油微量營養成分在加工過程中的分析和劉存存[6]對茶油加工過程中不同階段生物活性成分含量的分析看，脫臭工序是山茶油中角鯊烯損失最多的環節，從而使角鯊烯富集于脫臭餾出物中。

皂化分離法能將脫臭餾出物中的大量油脂形成脂肪酸鹽，再通過水洗除去，利用有機溶劑萃取不皂化物，第一次濃縮富集角鯊烯。通過硅膠進一步分離不皂化物，收集洗脫液進行檢測，合并含有角鯊烯的相同成分，純化角鯊烯。相比于超臨界CO2萃取、分子蒸餾法以及酶法提取法，皂化分離法和柱層析法相結合，操作簡便易行，設備投入低，維護少，有較大的分離容量及固定相價廉且能反復多次使用等優點，能夠實現產業化生產。主要的缺點是分離時間太長，可以采用頂部加壓法縮短分離時間并提高分離效率[7]。

研究對山茶油脫臭餾出物中角鯊烯的提取工藝進行探究，為從山茶油脫臭餾出物中提取天然角鯊烯提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山茶油脫臭餾出物；角鯊烯標準品(純度≧98%)；100～200目硅膠、200～300目硅膠；氫氧化鉀、90%乙醇、無水乙醇、正己烷、乙酸乙酯、無水硫酸鈉。

7890B 氣相色譜儀；HP-5色譜柱(30.0 m×0.32 mm×0.25 μm)；SHB-ⅢA循環水式多用真空泵；RE-52旋轉蒸發儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 不皂化物的制備

參考GB/T 5535.2—2008并稍作修改[8]。準確稱取山茶油脫臭餾出物10.00 g于500 mL具塞圓底燒瓶中。加入不同體積、不同濃度的氫氧化鉀-乙醇溶液后，于一定溫度下，反應不同時間。待反應完全，從冷凝管頂部加入50 mL蒸餾水后冷卻至室溫，或在流水中加速冷卻。將反應液轉移至250 mL分液漏斗中，加入50 mL正己烷，萃取3次，合并萃取液。分多次用25 mL 10%乙醇水溶液清洗萃取液，直至流出液不使酚酞變紅為止。若清洗過程出現乳濁現象，可添加少量無水乙醇進行破乳。將萃取液過無水硫酸鈉脫水后，進行旋蒸，得不皂化物，充入氮氣于4 ℃冰箱放置，備用。

1.2.2 氣相色譜條件

HP-5毛細管色譜柱(30.0 m×0.32 mm×0.25 μm)；程序升溫：初始溫度160 ℃，保持2 min；以15 ℃/min上升至280 ℃，保持5 min；再以5 ℃/min上升至300 ℃，保持2 min。檢測器溫度330 ℃，進樣口溫度300 ℃，不分流。

1.2.3 角鯊烯標準曲線的繪制

準確稱取20 mg角鯊烯標品，用正己烷定容到10 mL，得2 mg/mL角鯊烯標準儲備液。分別取0.05、0.25、0.50、1.00、7.50 mL儲備液，用正己烷定容至10 mL，得到各濃度。以峰面積為縱坐標(y)，各質量濃度為橫坐標(x)，繪制標準曲線。

1.2.4 角鯊烯含量和提取率的測定

稱取不皂化物0.03 g，正己烷定容至3 mL。吸取1 mL溶液過0.45 μmol/L有機濾膜，進氣相待測。

1.2.5 單因素實驗及純化實驗

采用皂化法提取山茶油脫臭餾出物中的角鯊烯，對堿濃度、料液比、反應時間、反應溫度進行單因素實驗。準確稱取0.075 g不皂化物，采用200～300目硅膠對不皂化物中的角鯊烯做進一步分離純化。采用干法上樣，洗脫劑為正己烷∶乙酸乙酯=100∶1進行洗脫，每10 mL為一管進行收集，氣相進行檢測，根據標曲計算各管角鯊烯含量。

1.2.6 日內精密度與日間精密度

在精煉山茶油中添加角鯊烯標準溶液，按照1.2.1的處理方式，選取10、100、500、1 000 μg/mL 4個濃度進行精密度和回收率的實驗。日內精密度每個濃度平行測定6次，日間精密度每個濃度平行測定3次，連續測定5 d，取平均值，計算結果。

1.2.7 抗氧化性實驗

分別添加不同濃度的角鯊烯純化物和0.02%TBHQ、0.02%BHT和0.01%沒食子酸丙酯于自制豬油中，并采用Rancimat氧化分析儀對其抗氧化性進行評估。

2 結果與分析

2.1 角鯊烯標準曲線的繪制

角鯊烯標準品氣相檢測如圖1所示，在13.907 min左右出峰。角鯊烯標準曲線見圖2，y軸為峰面積，x軸為角鯊烯濃度(μg/mL)，線性回歸方程為：y=2.419 4x-23.43，R2=0.999 6。

圖1 角鯊烯標準品

圖2 角鯊烯標準曲線

2.2 單因素實驗

2.2.1 反應溫度對角鯊烯含量和提取率的影響

在堿濃度1.0 mol/L，料液比1∶5下，反應時間60 min下，探究反應溫度分別為60、70、80、90、100 ℃時對角鯊烯含量和提取率的影響。

由圖3a和圖4a可知，隨著反應溫度的升高，角鯊烯含量先上升后下降，在70 ℃時達到最高，為30.6%。皂化反應是一個吸熱反應，當溫度較低時，反應速率慢，皂化不充分，剩余過多的脂肪酸，使得角鯊烯含量減少，提取率較高；隨著溫度上升，反應加快。但溫度過高時，角鯊烯在高溫堿性條件下反應時間過長，會加劇損失，使得含量和提取率均下降。

圖3 不同因素對角鯊烯含量的影響

圖4 不同因素對角鯊烯提取率的影響

2.2.2 反應時間對角鯊烯含量和提取率的影響

在90 ℃，堿濃度1.0 mol/L，料液比1∶5下，探究反應時間分別為30、60、90、120、150 min時對角鯊烯含量和提取率的影響。

由圖3b和圖4b可知，隨著反應時間的增加，在90 min時含量達到最高，反應時間加長，角鯊烯的含量和提取率均有較大幅度的下降。這是由于在高溫堿性條件下，時間越長，角鯊烯被破壞的越多，損失量均增大。而時間過短，反應不充分，提取率雖然較高，但含量較低，增加了后續純化的難度[9]。

2.2.3 堿濃度對角鯊烯含量和提取率的影響

在90 ℃，料液比1∶5，反應時間60 min下，探究堿濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0 mol/L時對角鯊烯含量和提取率的影響。

由圖3c和圖4c可知，隨著堿濃度的升高，角鯊烯含量呈上升趨勢，在1.5 mol/L時達到最高；提取率則呈現緩慢下降的趨勢。這是由于在低濃度時，皂化不完全，殘留過多的脂肪酸，水洗不能去除，導致角鯊烯在不皂化物中的含量過低；隨著濃度的升高，皂化更加徹底，反應更完全，角鯊烯得到富集，但過量的堿也可能導致角鯊烯被破壞，因此提取率下降[10]。

2.2.4 料液比對角鯊烯含量和提取率的影響

在90 ℃，堿濃度1.0 mol/L，反應時間60 min下，探究料液比分別為1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9時對角鯊烯含量和提取率的影響。

由圖3d和圖4d可知，隨著料液比增加，角鯊烯含量先上升后下降，提取率呈下降趨勢。在料液比1∶7左右時，脫臭餾出物與堿溶液反應較完全，因此角鯊烯含量高。但隨著堿液量的增加，角鯊烯在高溫下被破壞的量也隨之增加，從而提取率有所下降。

2.3 正交實驗

以角鯊烯含量和提取率為指標，選取堿濃度、料液比、反應時間、反應溫度4個因素,每個因素3水平作為變量，設計L9(34)因素水平表，見表1，實驗結果見表2。

表1 正交實驗因素水平表

表2 角鯊烯含量和提取率正交實驗結果表

從表2可知，經正交優化后，角鯊烯的含量和提取率均大幅提升，含量除第一組外均達到30%及以上，提取率除第二、三組外，也都達到了60%以上。由于角鯊烯含量相差不大，選取提取率進行數據極差分析。通過極差分析結果來看，影響角鯊烯提取率的因素主次順序分別為A>C>D>B，即堿濃度>反應溫度>反應時間>料液比。綜合分析可知，實驗最優方案為A2B2C1D3，即堿濃度1.3 mol/L,料液比1∶6，反應時間60 min，反應溫度90 ℃，并在此條件下重復實驗，含量和提取率分別為35.22%和81.97%。

2.4 日內精密度及日間精密度

角鯊烯的加標回收率及日內精密度與日間精密度結果見表3和表4。

表3 山茶油樣品中角鯊烯的加標回收率及日內精密度

表4 山茶油樣品中角鯊烯的加標回收率及日間精密度

從表3可得，日內精密度檢測中加標回收率在98.75%～102.39%之間，RSD值在1.60～7.73之間；從表4可得，日間精密度檢測中加標回收率在98.45%～102.55%，RSD值介于4.00～8.99，兩者都符合RSD<10%的規定。

2.5 角鯊烯分離純化

硅膠柱層析進一步純化不皂化物，獲得角鯊烯純品。純化結果如圖5所示，氣相色譜檢測(第23管)如圖6所示。

圖5 硅膠柱分離不皂化物中角鯊烯

圖6 純化后角鯊烯氣相色譜檢測(第23管)

從圖6可知，在第18管時，角鯊烯開始富集，并在第23管的時候達到最高值，之后逐漸減少，到第35管左右含量明顯減少。圖5可以看到經硅膠分離后，角鯊烯的純度得到極大的提升，從第20管到第34管，角鯊烯的出峰圖像均與第23管相似。因此，通過200～300目硅膠純化不皂化物中的角鯊烯，可得到有效富集，收率達到94.5%，純度為90%。

2.6 Rancimat 氧化分析實驗

在130 ℃下，比較了不同濃度角鯊烯提取物和不同抗氧化劑及復配后的抗氧化性效果，結果見圖7、圖8。

注：與豬油組比較，不同字母表示有顯著性差異(P<0.05)。圖7 不同濃度角鯊烯對豬油的抗氧化作用

注：A：豬油 0.02%角鯊烯純化物；B： 0.02%BHT 0.02%角鯊烯純化物+0.02%BHT；C： 0.01%PG 0.02%角鯊烯純化物+0.01%PG；D：0.02%TBHQ 0.02%角鯊烯純化物+0.02%TBHQ。*表示該組相比較于組內有顯著性差異(P<0.05)。圖8 抗氧化劑復配對豬油的抗氧化作用

從圖7可知，添加了0.02%角鯊烯純化物的豬油誘導時間顯著提升，表明該濃度下的角鯊烯可有效增強油脂的抗氧化性(P<0.05)，但在高濃度時誘導時間反而降低，可能是角鯊烯自身被氧化后的產物加劇了油脂的氧化；在圖8中，抗氧化劑均能顯著提高豬油的抗氧化性(P<0.05)，而TBHQ的作用效果最佳，BHA和PG次之且作用效果相當。不過當角鯊烯提取物與各抗氧化劑復配使用時，PG與角鯊烯的復配有顯著的增益效果(P<0.05)，而其余的復配效果不顯著(P>0.05)。

3 結論

山茶油含有豐富的、有利于人體健康的代謝產物，如植物甾醇、維生素E、角鯊烯等，但脫臭環節真空、高溫的條件，使得這些代謝產物損失嚴重。本研究結合皂化法和柱層析法，從山茶油的脫臭餾出物中富集和純化角鯊烯。此方法不僅降低了生產成本，同時也提高了天然產物的利用率，避免了企業在設備上的昂貴投入和維護。最優提取條件為堿濃度1.3 mol/L，料液比1∶6，反應時間60 min，反應溫度90 ℃。在此條件下角鯊烯質量分數為35.22%，提取率為81.97%，實測值與預測值接近。通過硅膠柱層析進一步分離純化角鯊烯，收率為94.5%，純度為90%。此外，對其抗氧化性進行探究，發現0.02%的提取物有較好的抗氧化性，但在高濃度時有促氧化的作用。通過協同作用可促進其他抗氧化劑的效果，因此可以作為油脂中其他天然或合成抗氧化劑的增效劑復合使用。