TRPV1介導溫和灸影響佐劑性關節炎小鼠iNOS的實驗研究*

吳曉靜 姜勁峰 蔣 穎 李杰俊

南京中醫藥大學 江蘇 南京 210019

一氧化氮（NO）參與了炎癥反應過程，高表達一氧化氮合酶（iNOS）和NO過量產生是關節炎[1]、膿毒血癥[2]等病癥的病理環節。抗炎是灸法的普遍性效應規律[3]。我們前期的研究已經證明了TRPV1介導溫和灸對于氟氏佐劑炎癥模型的抗炎[4]和鎮痛[5]中的作用。辣椒素（TRPV1激動劑）抑制LPS和IFN-γ介導的巨噬細胞表達iNOS和產生NO[6]；隔餅灸有效降低膝關節炎模型兔血清、關節滑液和軟骨中的iNOS含量，減輕關節軟骨損傷[7]。溫和灸是否通過TRPV1介導影響了iNOS——炎癥的普遍性環節？我們設計本研究試圖回答該問題。總結匯報如下。

1 材料與方法

1.1 實驗設計：本研究由兩部分實驗組成，分述如下。

1.1.1 實驗一：“TRPV1拮抗劑影響溫和灸對佐劑性關節炎癥模型小鼠的抗炎效應及與iNOS的相關性”。利用辣椒平（TRPV1拮抗劑）阻斷溫和灸效應途徑，觀察辣椒平對溫和灸抗炎效應及其iNOS的影響。

1.1.2 實驗二：“溫和灸對TRPV1-/-佐劑性關節炎癥模型小鼠iNOS的影響”。對比觀察溫和灸對TRPV1-/-模型小鼠及其野生型小鼠抗炎作用、影響iNOS的差異。

1.2 動物及分組：分述如下。

1.2.1 實驗一：健康成年昆明（KM）雄性小鼠50只，體重35±2g（上海斯萊克實驗動物有限公司，合格證號2007000547161），隨機分為5組：正常組、模型組、溫和灸組、辣椒平組、溫和灸+辣椒平組，每組各10只。

1.2.2 實驗二：C57BL/6野生型小鼠16只（體重16～20g）、J003770TRPV1基因敲除小鼠16只，體重17～20g（南京大學實驗動物中心，合格證號20100001）。分組：C57BL/6野生型小鼠隨機分為野生模型組和野生溫和灸組，每組各8只。16只TRPV1基因敲除小鼠隨機分為KO模型組和KO溫和灸組，每組各8只。

1.3 造模：實驗第1天，將20μl完全弗氏佐劑（sigma公司）皮內注射于小鼠右后足跖，監測小鼠足跖容積。24h之后，根據關節炎指數評分表，對模型小鼠足跖關節進行評定，若分數＞4分，則表示造模成功。

1.4 干預方法：分述如下。

1.4.1 溫和灸組：選取小鼠脊柱L5、L6區域，備皮，暴露1cm×1cm皮膚，特制細艾條（5mm×200mm，南陽漢醫有限公司）于選定區域懸灸20min，燃燒端距離皮膚12±2mm。同時，測溫儀（HC-04型，杭州洪昌科技有限公司）監測小鼠施灸部位皮膚溫度，保持在44±1℃。

1.4.2 辣椒平組：辣椒平溶于二甲基亞砜，生理鹽水稀釋配備為0.01%辣椒平溶液。從實驗第2d起，小鼠腹腔注射辣椒平0.1ml/10g，每天1次，總共7d。

1.4.3 溫和灸+辣椒平組：給予小鼠腹腔注射辣椒平（劑量同辣椒平組），15min后溫和灸（方法同溫和灸組）。干預時間：實驗第2至第8d。

1.5 指標測量：分述如下。

1.5.1 足跖腫脹度：足跖容積測量儀（YLS-7B，濟南益延科技發展有限公司）測量各組小鼠的右后足跖容積。測量時間：第1、2、4、6、8d。

1.5.2 血清指標：實驗第8d，對實驗小鼠行摘眼球取血。每只1.5ml，離心分離血清，收集0.5ml血清至1.5ml離心管，-20℃冰箱中保存。酶聯免疫吸附法（Elisa）檢測血清TNF-α，IL-1β；血清中硝酸還原酶法檢測NO含量；比色法檢測iNOS含量。所有檢測由江蘇省南京凱基生物有限公司完成。

1.6 統計學方法：采用SPSS21.0統計軟件進行分析，計量資料以±s表示。實驗中各組數據先進行正態性和方差齊性檢驗，在滿足正態分布和方差齊性的情況下采用單因素方差分析LSD法進行多重比較。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 辣椒平干預處理對溫和灸及佐劑性關節炎模型小鼠的抗炎效應及其iNOS的影響：分述如下。

2.1.1 足跖腫脹度：如表1所示，實驗第8d，模型組足趾腫脹度高于正常組（P＜0.01），表明造模成功；溫和灸組、辣椒平組、溫灸+辣椒平組足趾腫脹度均低于模型組（P＜0.01），表明三組干預均可改善CFA佐劑性關節炎模型小鼠的足趾腫脹度；溫和灸組足趾腫脹度明顯低于溫和灸+辣椒平組（P＜0.05），表明辣椒平降低了溫和灸對模型小鼠足趾腫脹度的影響。

表1 溫和灸、辣椒平、溫和灸+辣椒平對CFA佐劑性關節炎小鼠足跖腫脹度影響（±s，ml，n=10）

表1 溫和灸、辣椒平、溫和灸+辣椒平對CFA佐劑性關節炎小鼠足跖腫脹度影響（±s，ml，n=10）

注：與正常組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01，*P＜0.05；與溫和灸組比較：#P＜0.05。

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2.1.2 炎癥因子：如表2所示，實驗第8d，模型組IL-1β、TNF-α、NO、iNOS明顯高于正常組（P＜0.01）；溫和灸組、辣椒平組、溫和灸+辣椒平組IL-1β、TNF-α、NO、iNOS均明顯低于模型組（P＜0.01）；辣椒平組、溫和灸+辣椒平組IL-1β、TNF-α、NO、iNOS明顯低于溫和灸組（P＜0.01）。

表2 溫和灸、辣椒平、溫和灸+辣椒平對CFA佐劑性關節炎小鼠IL-1β、TNF-α、NO、iNOS的影響（±s，n=10）

表2 溫和灸、辣椒平、溫和灸+辣椒平對CFA佐劑性關節炎小鼠IL-1β、TNF-α、NO、iNOS的影響（±s，n=10）

注：與正常組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01，*P＜0.05；與溫和灸組比較，#P＜0.05。

組別正常組模型組溫和灸組辣椒平組溫和灸+辣椒平組iNOS（U/ml）0.41±0.23 22.14±0.94▲▲6.33±0.72▲▲**9.18±1.28▲▲**##14.8 ±1.10▲▲**##IL-1β（pg/ml）31.39±1.86 83.45±8.61▲▲34.65±3.74▲▲**50.55±1.27▲▲**##71.02±1.85▲▲**##TNF-α（pg/ml）24.82±1.65 66.29±3.44▲▲31.00±1.22▲▲**37.18±1.08▲▲**##51.85±1.61▲▲**##NO(μmol/L)4.96±1.94 83.93±2.63▲▲30.87±1.12▲▲**36.38±2.21▲▲**##37.84±2.59▲▲**##

2.2 溫和灸對TRPV1-/-佐劑性關節炎模型小鼠的抗炎效應及與iNOS的影響：分述如下。

2.2.1 足跖腫脹度：如表3所示，實驗第8d，與野生模型組相比，野生溫灸組足趾腫脹度有明顯下降（P＜0.01）；與TRPV1-/-模型組相比，TRPV1-/-溫和灸組足趾腫脹度沒有明顯變化（P＞0.05）。

表3 溫和灸對TRPV1-/-、野生型CFA佐劑性關節炎小鼠足跖腫脹度的影響（±s，ml，n=8）

表3 溫和灸對TRPV1-/-、野生型CFA佐劑性關節炎小鼠足跖腫脹度的影響（±s，ml，n=8）

注：與野生模型組比較：**P＜0.01。

組別野生模型組野生溫和灸組TRPV1-/-模型組TRPV1-/-溫和灸組Day 8 0.302±0.016 0.259±0.017**0.292±0.003 0.280±0.010 Day 1 0.171±0.012 0.177±0.010 0.153±0.011 0.159±0.008 Day 2 0.256±0.014 0.250±0.019 0.283±0.016 0.287±0.033 Day 4 0.262±0.018 0.253±0.019 0.280±0.015 0.288±0.018 Day 6 0.311±0.029 0.286±0.014 0.290±0.025 0.286±0.012

2.2.2 炎癥因子：如表4所示，實驗第8d，與野生模型組相比，野生溫和灸組血清IL-1β、TNF-α、NO含量、iNOS活性有明顯下降（P＜0.01）；與TRPV1-/-模型組相比，TRPV1-/-溫和灸組 IL-1β、TNF-α 無明顯變化（P＞0.05）。TRPV1-/-溫和灸組小鼠經過7d溫和灸后血清中NO含量、iNOS活性與TRPV1-/-模型組小鼠相當（P＞0.05）。

表4 溫和灸對TRPV1-/-、野生型CFA佐劑性關節炎小鼠IL-1β、TNF-α、血清NO含量、iNOS活性的影響（±s，n=8）

表4 溫和灸對TRPV1-/-、野生型CFA佐劑性關節炎小鼠IL-1β、TNF-α、血清NO含量、iNOS活性的影響（±s，n=8）

注：與野生模型組比較，**P＜0.01。

組別野生模型組野生溫和灸組TRPV1-/-模型組TRPV1-/-溫和灸組IL-1β（pg/ml）82.93±3.39 65.99±5.45**79.98±1.67 75.44±2.05 TNF-α（pg/ml）58.63±1.96 38.06±1.52**44.98±1.95 44.39±2.01 NO(μmol/L)49.45±2.91 26.36±0.89**67.10±1.52 64.57±2.09 iNOS（U/ml）17.50±0.73 8.78±1.06**12.41±0.31 11.61±0.49

3 討論

TRPV1是溫和灸抗炎的分子效應途徑。通過觀察溫和灸對炎癥模型的影響，我們驗證了溫和灸的抗炎效應由TRPV1介導，TRPV1是溫和灸的主要效應途徑[4]。

TRPV1介導iNOS表達下調是艾灸抗炎效應途徑之一。外周血細胞均表達TRPV1[9]，而NO是炎癥反應的關鍵介質。iNOS在單位時間內釋放的NO量比結構型NOS（內皮源性eNOS、神經元性nNOS）大1000倍[10]。TRPV1在炎癥的加劇與發展相關，NO水平降低是相關表現之一[11]。iNOS抑制劑在感染性休克實驗中顯示了療效[12]，目前臨床缺少有效以iNOS為靶向治療的特異性藥物治療方法。因此，本研究的結果為臨床運用灸法抑制炎癥反應提供了理論依據。

溫和灸下調iNOS、降低NO量為艾灸治療臨床危重急癥提供支撐。文獻記載神闕灸是古代危重急癥的常見急救措施[13]。iNOS源性NO是炎癥反應中炎癥遞質瀑布樣連鎖反應的最終共同遞質之一，也是導致感染性休克的關鍵遞質[14]，是感染性休克血壓降低、微循環障礙的關鍵分子[15]。iNOS源的NO釋放量增加是感染性休克、全身炎癥反應綜合征（SIRS）的主要病理環節。在本研究結論的基礎上，臨床結合腧穴的部位特異性（如神闕）可以進一步放大抑制iNOS、降低NO量的治療靶向性，提高臨床治療效力；同時避免iNOS抑制劑的副反應[16]。

展望：在明確了TRPV1介導溫和灸抗炎、降低iNOS表達的機制基礎上，進一步研究溫和灸抗應激的iNOS機制以及針對不同病理靶向的有效應用于臨床的溫和灸操作方法具有可行性。