益腎安胎中藥對腎虛型復發性流產母胎界面PI3K信號通路的影響*

樓毅云 吳曉婷 傅 萍

浙江省杭州市中醫院 浙江 杭州 310007

復發性流產發病機制復雜，是生殖醫學領域中亟待解決的問題之一。本研究從復發性流產腎虛證入手，發現腎虛型復發性流產者子宮蛻膜中PI3K信號通路的相關分子血清和糖皮質激素激酶（SGK1）以及透明質酸合成酶（HAS1、HAS2、HAS3）、透明質酸酶（Hyal-2）透明質酸合成酶的mRNA表達量顯著降低，提示復發性腎虛自然流產與子宮蛻膜中PI3K信號通路的下調相關，應用益腎安胎中藥提高蛻膜細胞中PI3K、SGK1HAS1、HAS3、Hyal-2的表達。現將研究結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：經杭州市中醫院倫理委員會批準，以2012年6月～2016年12月期間妊娠早期（妊娠12周之前），并且依從性強，愿意配合隨訪的妊娠患者為研究對象，均符合相關中西醫診斷和納入標準[1-2]。選取復發性流產腎虛證者30例為實驗組，年齡20～39歲，平均28.62±2.69歲，自然流產次數2～4次，平均2.17±0.45次，孕周7～11周，平均8.80±2.97周。正常早期妊娠的孕婦要求人工流產者30例作為對照組，年齡22～34歲，平均27.00±5.08歲，自然流產次數0～3次，平均1.58±0.21次，孕周5～10周，平均7.41±2.44周。兩組患者年齡及孕周比較，無統計學差異（P＞0.05）。

1.2 樣本收集及處理：按照材料所述納入和排除標準進行實驗組和對照組標本采集和分析，進行分組。預先準備好裝有生理鹽水的50ml離心管，將清宮術后的蛻膜組織放入生理鹽水中，冰盒內術后30分鐘運輸至實驗室。生理鹽水沖洗蛻膜組織，吸水紙吸凈組織表面生理鹽水。凍存管分裝后放在液氮中凍存30～60min。取出，放入-80℃冰箱長期保存。

1.3 藥物制備：精密稱取菟絲子、覆盆子、桑寄生、苧麻根各200g，阿膠、當歸、杭白芍粉各150g，碎成粗粉，混合，進行回流提取，提取后旋轉蒸發濃縮，濾過，濾液減壓回收定容至250ml，分裝滅菌，備用。每劑處方所含成分以金絲桃苷和槲皮素作為質控標準（經LC-MS測定）。取1ml滑胎安胎協定方混合提取物（2g/ml），加入完全培養液，配制成濃度為30mg/ml母液，EP管分裝，每支10ml，-20℃凍存備用，使用前稀釋至終濃度。

1.4 原代人蛻膜細胞培養：無菌條件下獲得正常早期妊娠清宮術中蛻膜組織，置于含有1%雙抗的培養基中，在無菌條件下，用已消毒的眼科剪將蛻膜組織剪碎成糊狀，消化，過濾，置于1000rpm，離心，裂解，置于5%CO2培養箱內培養。以上中藥處理蛻膜細胞培養過夜，另設空白對照組。

1.5 檢測內容及方法：分述如下。

1.5.1 免疫組化檢測：實驗組和對照組新鮮蛻膜組織用中性緩沖福爾馬林固定12～24小時后，梯度酒精脫水，石蠟包埋并切片。高溫高壓抗原修復后滴加PI3K一抗，37℃下孵育，PBS沖洗，滴加山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體，沖洗后顯色。Harris蘇木素液復染細胞核，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.5.2 RT-PCR檢測母胎界面PI3K通路相關基因的表達水平：實驗組和對照組蛻膜組織基因組抽提后進行總RNA濃度測定，PCR擴增后，采用應用逆轉錄聚合酶鏈反應法（RT-PCR）測定蛻膜細胞中PI3K通路相關基因的表達水平；原代人蛻膜細胞培養后，測定蛻膜組織中表達有差異的基因在蛻膜細胞空白組和中藥組的表達水平。

1.6 統計學分析：應用spss16.0統計軟件，計量資料以均數±標準差(±s)表示，進行方差分析或t檢驗，以P＜0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 PI3K在蛻膜組織中的表達：本研究對實驗組和對照組子宮蛻膜組織進行免疫組織化學實驗，結果顯示PI3K在早期妊娠蛻膜組織中有表達，H-score評分半定量分析（圖1）顯示實驗組蛻膜組織中PI3K的表達低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）。

圖1 H-score評分半定量分析早期妊娠蛻膜組織中PI3K的表達

圖2 兩組蛻膜組織中相關基因mRNA水平

2.2 PI3K信號通路上相關基因子宮蛻膜組織mRNA相對表達：實驗組和對照組子宮蛻膜組織，以GAPDH為內參，對PI3K、SGK1、HAS1、HAS2、HAS3、Hyal-1、Hyal-2及Hyal-3的表達進行Real time PCR分析，PI3K在實驗組中的相對表達量顯著低于對照組，差異具有統計學意義（P＜0.01)；PI3K信號通路上相關分子SGK1、HAS1和HAS3在實驗組中的相對表達量顯著低于對照組，差異具有統計學意義（P＜0.01)；HAS2在實驗組中的相對表達量低于正常妊娠組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。Hyal-1與GAPDH相比在實驗組和對照組中表達量無顯著性差異（P＞0.05）；Hyal-2在實驗組中的相對表達量顯著低于對照組，差異具有統計學意義（P＜0.01)；Hyal-3與GAPDH相比在實驗組和對照組中表達量無顯著差異（P＞0.05)。見圖2。

2.3 益腎安胎中藥對蛻膜細胞PI3K信號通路上相關基因mRNA相對表達的影響：益腎安胎中藥處理人蛻膜細胞，對中藥組和空白組蛻膜細胞中PI3K、SGK1、HAS1、HAS2、HAS3、Hyal-2的表達進行Real time PCR分析，PI3K在中藥組中的相對表達量明顯高于空白組，差異具有統計學意義（P＜0.01)，SGK1、HAS1和Hyal-2在中藥組中的相對表達量高于空白組，差異具有統計學意義（P＜0.05)；HAS3在中藥組中的相對表達量低于空白組，差異具有統計學意義（P＜0.01)；HAS2在兩組中表達量無顯著差異（P＞0.05)。見圖3。

圖3 益腎安胎中藥對蛻膜細胞PI3K信號通路上相關基因mRNA相對表達的影響

3 討論

早期妊娠丟失，是孕期常見現象，據統計臨床妊娠中僅30%～50%的妊娠能維持至妊娠20周以上，其中約75%的妊娠丟失發生在妊娠早期，即妊娠12周前的早期流產[3]。自然流產連續發生2次及以上則為復發性流產，本病不僅給患者帶來生理痛苦，可造成夫婦心理負擔[4]，甚則會影響到家庭關系的穩定，是生殖醫學領域中亟待解決的問題之一。歷代醫家多認為本病為腎虛、脾虛、血熱、氣血虛弱、血瘀等所致。但腎為先天之本，主生殖，主藏精而系胞胎。婦人受妊，本于腎氣之旺。胎者也，本精與血之相結而成，胎孕既成，則有賴先天精氣之滋養及腎氣之鞏固。腎氣旺盛，臟腑協調，胞宮安和，胎者泰然蓬生，自無墮胎之虞，若腎氣匱乏，封藏失職，沖任不固，胞胎難系，即成墮胎之疾[5]。故病因雖多，眾醫家仍以腎為關鍵。因此，中醫治療以補腎固沖為安胎預防復發性流產的基本之法，臨證多遣用菟絲子、桑寄生、阿膠等益腎安胎、養血斂精之品[6]。臨床上常適加益氣健脾之品，使先后天同補，氣血得生，胎元得固，而達到保胎養胎之目的。即使是其他因素所致胎元不固而發生的流產，亦常以補腎為大法加減化裁而取得良效。臨床報道，中藥補腎之法提高先兆流產患者血清人絨毛膜促性腺激素、孕激素、雌二醇的水平，緩解先兆流產的臨床癥狀，阻止其進一步向自然流產的發展，從而提高先兆流產的治愈率[7]。

PI3K是哺乳動物細胞內基礎信號轉導途徑中的主要細胞因子之一，在細胞的生長、增殖、代謝、遷移、分化、凋亡、血管生成、自吞噬等多種生理功能和病理過程中發揮著極其重要的生物學功能，PI3K及其相關轉導因子紊亂在神經系統病變、自身免疫性疾病、造血系統疾病和惡性腫瘤等多種病變均有報道[8]。基因修飾的小鼠模型研究表明，PI3K及其相關轉導因子在卵細胞發育與激活、卵泡發育與排卵、卵細胞減數分裂的重啟與胚胎早期的發育、小鼠卵巢腫瘤以及乳腺腫瘤的發生和發展中起重要作用[9]。研究表明PI3K相關轉導因子中的上游分子PI3K家族中class I催化亞基的p110 delta亞型（Pik3cd基因編碼）在介導外源性激素如雌激素（estrogen）和卵泡刺激素（FSH）影響下的卵巢顆粒細胞分泌及卵泡生長中起重要的作用，其缺失后會影響顆粒細胞的生長和增殖，進而影響后續早期妊娠胚胎的發育與生存[10]。

本研究結果發現正常妊娠對照組子宮蛻膜高表達PI3K，腎虛型復發性流產患者子宮蛻膜中PI3K以及PI3K信號通路上相關分子SGK1以及HAS1、HAS2、HAS3、Hyal-2的表達明顯下降。應用益腎安胎中藥（菟絲子、覆盆子、桑寄生、苧麻根、阿膠、當歸、杭白芍）處理人蛻膜細胞，PI3K、SGK1、HAS1、HAS3和Hyal-2的相對表達量增加。本研究得出結論腎虛型復發性流產者子宮蛻膜中PI3K信號通路上相關分子PI3K以及SGK1、HAS1、HAS2、HAS3、Hyal-2的mRNA表達量顯著降低，并且HAS1、HAS2、HAS3的蛋白表達較正常妊娠組減少，腎虛自然流產與子宮蛻膜中PI3K信號通路的下調相關。益腎安胎中藥提高蛻膜細胞中PI3K、SGK1、HAS1、HAS3和Hyal-2的表達，益腎安胎中藥可通過調節PI3K信號通路從而改善妊娠結局。

本研究通過研究腎虛型復發性流產和正常妊娠孕婦母胎界面PI3K信號通路上相關分子的表達，分析母胎界面PI3K及其信號通路上相關分子的表達與腎虛型復發性流產的聯系；通過研究益腎安胎中藥對蛻膜細胞PI3K及其信號通路上相關分子表達改變的影響，進一步闡述母胎界面PI3K及其信號通路上相關分子的表達影響妊娠結局的機理，為中醫藥補腎治療提供實驗依據，進一步為復發性流產發病機制及中醫藥防治的研究提供新的思路和途徑。