黃芪桂枝五物湯顆粒質量標準研究

范越，張文娓，田明*，隋思逸，康天濟，唐慧蓮，田冰，王旭，閆麗莉

(1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040)

黃芪桂枝五物湯出自于張仲景的《金匱要略》，由桂枝、黃芪、大棗、生姜和芍藥5味中藥材共同組成，具有調和營衛，溫經通痹的功效，治療血痹氣痹，至今在中醫臨床中仍被廣泛的應用，其辨證要點是肌膚麻木不仁、或疼痛，在臨床中糖尿病周圍神經病變符合血痹證辨證要點。本課題的前期研究也證明了其療效作用[1-2]。為了更好的控制黃芪桂枝五物湯顆粒質量，建立其質量標準，采用薄層色譜法對黃芪、白芍進行定性鑒別；采用高效液相色譜法測定制劑中主藥黃芪的指標性成分——毛蕊異黃酮苷。具體研究結果如下。

1 試驗材料

1.1 儀器

紫外分析儀(上海顧村電光儀器廠，ZF-I型)；高效液相色譜儀(美國Waters公司，Waters1515型)；紫外檢測器(美國Waters公司，Waters 2487型)；可見紫外光譜掃描儀(日本島津，UV-1601PC)；超聲波清洗機(陜西鵬展科技，MP5200H)；電子分析天平(梅特勒—托利多儀器上海有限公司，AB204-N)；硅膠G薄層板(自制)；玻璃點樣毛細管(華西醫科大學儀器廠)。

1.2 試藥

白芍對照藥材(批號：120905-201008)、芍藥苷對照品(批號：110736-201136)、黃芪甲苷對照品(批號：110781-201113)、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品均來源于中國藥品生物制品檢定所；甲醇(色譜純)；甲醇、乙醚、乙酸乙酯、甲酸、三氯甲烷、正丁醇等試劑均為分析純；黃芪桂枝五物湯顆粒劑(自制)。

2 薄層色譜鑒別

2.1 黃芪TLC鑒別

2.1.1 黃芪的供試品溶液制備

取本品顆粒劑10 g，研細，加入蒸餾水40 mL使其溶解，用乙醚振搖提取2次，每次40 mL，棄去乙醚液，水溶液用水飽和的正丁醇提取2次，每次40 mL，合并正丁醇液，0.5%的氫氧化鈉溶液洗滌2次，每次40 mL，正丁醇液用水洗至中性，置水浴上蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。

2.1.2 對照品溶液的制備

取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.1.3 陰性供試品溶液的制備

取按制備工藝處方1/10量制成不含黃芪的陰性樣品，按“2.1.1”項下方法制成陰性供試品溶液。

2.1.4 薄層色譜方法

參照薄層色譜法[3](《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB)試驗，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-水(13∶7∶2)的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。日光燈下檢視，斑點為棕褐色。

2.2 白芍的TLC鑒別

2.2.1 供試品溶液的制備

取本品5 g，研細，加甲醇15 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水15 mL使溶解，加水飽和正丁醇提取3次，每次15 mL，合并正丁醇提取液，再用正丁醇飽和的水洗滌3次，每次15 mL，取正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。

2.2.2 對照品溶液的制備

取芍藥苷照品適量，加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.2.3 對照藥材溶液的制備

取白芍對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。

2.2.4 陰性供試品溶液的制備

取按制備工藝處方1/10制成不含白芍的陰性樣品，按照“2.2.1”項下方法制成陰性供試品溶液。

2.2.5 薄層色譜方法

照薄層色譜法《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB試驗，吸取上述供試品溶液10 μL、對照品溶液各1 μL、對照藥材6 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(8∶1∶2∶0.04)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。

2.3 結果分析

在日光燈下，供試品有Rf值為0.31的藍色斑點、Rf值為0.67的深黃色斑點；對照藥材只有一個Rf值為0.31的藍色斑點；對照品也有一個Rf值為0.31的藍色斑點；陰性對照有Rf值為0.67的深黃色斑點。供試品在Rf值為0.31處的斑點與對照藥材和對照品斑點相互對應。陰性樣品在芍藥苷對照品相應的位置上沒有斑點。經多批樣品試驗，本法靈敏度高，專屬性好。

3 毛蕊異黃酮苷含量測定方法的建立

3.1 最佳吸收波長的測定

用甲醇配制一定濃度的毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品溶液，再用甲醇作為空白對照，在紫外分光光度計上于200～400 nm波長范圍內進行掃描，掃描結果見圖1。根據掃描結果可知，毛蕊異黃酮葡萄糖苷在260 nm處有最大吸收，參考2010年版《中國藥典》及相關文獻中毛蕊異黃酮苷的測定方法，確定260 nm為最佳吸收波長。

圖1 毛蕊異黃酮苷光譜圖

3.2 色譜條件

色譜柱十八烷基硅烷鍵合硅膠柱；流動相：乙腈-0.2%甲酸(15∶85)；檢測波長:260 nm；流速1.0 mL/min；柱溫：室溫;進樣量:10 μL。

3.3 對照品溶液的制備

精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品適量，加甲醇使溶解并轉移至10 mL容量瓶中，定容，搖勻，制成對照品溶液(216 μg/mL)。

3.4 供試品溶液的制備

取顆粒劑適量，研細，精密稱定3.056 3g，加水20 mL溶解，用正丁醇萃取3次，每次20 mL，合并正丁醇提取液，蒸干，殘渣用甲醇溶解，并定容至5 mL容量瓶中，微孔濾膜(0.45 μm)過濾，作為供試品溶液。

3.5 陰性對照溶液制備

按制備工藝處方1/10取除黃芪外其余所有藥材，按照制備工藝制備，制成黃芪陰性樣品；按照“3.4”供試品溶液處理方法，制成陰性對照品溶液。

3.6 標準曲線的制備及線性范圍的確定

精密吸取3.3項下對照品儲備溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mL分別置于5 mL容量瓶中，分別加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取上述溶液各10μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，標準曲線數據見表1。以峰面積A為縱坐標，含量C為橫坐標作線性回歸，得回歸方程A=28 878C+53 179，R=0.999 2,線性范圍0.216～1.512 μg,在此范圍內呈良好的線性關系，結果見圖2。

表1 毛蕊異黃酮葡萄糖苷線性回歸數據

圖2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷標準曲線

3.7 精密度實驗

精密吸取“3.4”項下供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，按含量測定項下色譜條件測定，連續進樣6次。結果，毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積RSD為1.54%，表明本方法精密度良好，見表2。

3.8 重復性考察

分別精密稱取同一批號下的黃芪桂枝五物湯顆粒劑(批號：20130401)6份，按“3.4”項下供試品溶液制備方法制備成供試品溶液，吸取供試品溶液和108 μg/mL的對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀中，測定峰面積，計算毛蕊異黃酮苷含量。結果RSD值小于5%，符合要求，重現性較好，表明本方法重復性良好。見表3。

表2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷精密度試驗結果

表3 毛蕊異黃酮葡萄糖苷重復性考察結果

3.9 穩定性試驗

精密吸取“3.4”項下的供試品溶液，在12 h內，每小時進樣1次，每次10 μL，結果毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積在0～10 h內的RSD=1.761 0%;在11 h時測得峰面積2 485 296,在0～11 h的RSD=4.127 9%>3%。結果表明在10 h內樣品溶液穩定性良好。結果見表4。

表4 毛蕊異黃酮葡萄糖苷穩定性試驗結果

實驗結果表明11 h內，樣品溶液中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量較穩定，而樣品從提取至測定一般在1 h內即可全部完成，建立的檢測方法可行。

3.10 加樣回收率試驗

分別精密稱取同一批次黃芪桂枝五物湯顆粒劑(批號：20130401)6份，精密加入2.43 mg/mL的毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品溶液1 mL，按照“3.4”項下供試品溶液處理方法處理，并進行含量測定，計算回收率，結果見表5。

回收率=(測得量-制劑含量)/添加對照品量×100%

表5 毛蕊異黃酮葡萄糖苷加樣回收率結果

結果,回收率在95%～105%之間，表明所建立的方法測定毛蕊異黃酮葡萄糖苷準確、可行。

3.11 樣品測定

取6批黃芪桂枝五物湯顆粒，分別精密稱取3 g，按照“3.4”項下供試品溶液處理方法處理，精密量取10 μL供試品，并采用高效液相色譜法(《中國藥典》2010版一部附錄VID)注入液相色譜儀測定，結果見表6。

表6 黃芪桂枝五物湯顆粒中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量

根據上述6批樣品的含量測定，平均每克顆粒劑含毛蕊異黃酮苷1.615 0 mg，由于藥材隨產地、批次不同，其含量略有差異。根據中藥新藥的研究要求，暫定黃芪桂枝五物湯顆粒劑每克含毛蕊異黃酮葡萄糖苷總計不少于1.20 mg。即每袋中的毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量不得少于12.0 mg。

4 討論

本研究對黃芪桂枝五物湯顆粒中的黃芪和白芍進行了薄層色譜鑒別,其結果斑點集中,層次清晰,重復性好,陰性無干擾,具有可操作性,因此可以作為黃芪桂枝五物湯顆粒的定性鑒別方法。采用高效液相色譜法建立了黃芪中毛蕊異黃酮苷含量測定方法，建立制劑中的最低限度，有效的控制了制劑的質量,并為藥理、藥效學基礎研究、臨床應用奠定了基礎。