一種無害化檢測布魯氏桿菌的方法

楚文慶 董 武

（內蒙古民族大學動物科學技術學院重點實驗室，內蒙古通遼 025000）

布病是由布魯氏菌屬細菌所引起的一種廣泛分布于世界各地的人獸共患傳染。布病的主要傳染源是牛、羊、豬，其中羊的布病對人的毒力性最強，致病力最高，對人的健康危害性也最大。

1 材料與儀器

omp22引物，流產型布魯氏桿菌DNA，水，2×Taq酶，移液槍，八連管；

ZR DNA Sequencing Clean-up Kit，PCR擴增儀，高速臺式離心機，電泳儀，紫外透射反射分析儀，凝膠自動成像系統；Nano Drop超微量分光光度計；甲醛溶液（40%，4%，0.4%），新潔爾滅溶液（30g/L，3g/L，0.3g/L），離心管，純化柱。

2 方法步驟

（1）DNA擴增：①引物稀釋：分別向omp22上下游引物加入228 μl與286 μL去離子水，振蕩離心；取10 μl稀釋液加入90 μl的水混合震蕩離心。

②配制擴增體系：加入25 μl的2×Taq酶，引物各2.5 μl，2 μl的DNA，18 μl的水至八連管中，混勻封好。

③設置擴增參數：stage1：95℃×1，1min；stage2：95℃（15sec）→60℃（15sec）→72℃（30 sec）共計35個循環；stage3：72℃×1（7 min）→4℃保存。

④電泳：配制2%的瓊脂糖凝膠電泳（其中加入GV-Ⅱ熒光染料），依次加入mark與DNA樣本，95℃進行30 min的電泳。

⑤凝膠回收：

⑥Ligation：

成分 體積10×T4DNA Ligation Buffer 1μl T4DNA Ligase（3U/μl） 1μl PGM-T載體（50ng/μl） 1μl目的片段 2μl ddH2O 5μl

（2）無害化處理布魯氏桿菌

①將測序結果可用且濃度為200ng/μl的DNA稀釋到40ng/μl，取出10μl的40ng/μlDNA于已經做好標記的1.5 ml的離心管（tube）中；

②將不同種類不同濃度的消毒劑按照與DNA1：1的比例混合到tube中，使DNA處理時間分別為10 min，30 min，1 h以及12h；

③將處理過的DNA進行純化，把②中的混合液轉移到純化柱中，加入240 μlSequencing Binding Buffer，離心12000 rpm，30 s；

④加入300 μl的Wash Buffer 12000rpm，30 s；

⑤重復步驟④兩次；

⑥加Elution Buffer 20 μl，換一個新tube，離心12000 r，30 s；

⑦電泳：PCR總反應為30 μl體系，2×Taq酶10μl，上下游布魯氏菌OMP引物1.5μl，DNA 1.5μl，去離子水15.5μl。95℃作用5 min，進入循環，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共計35個循環，然后72℃延伸7 min，4℃forever。

2%瓊脂糖凝膠電泳，電壓90V，時間30 min，凝膠成像系統觀察。

3 結果分析

PFA時間依存性

不一樣濃度多聚甲醛處置對布病DNA產量的影響。使用不同濃度的PFA處理布病DNA，10 min，30 min，1 h以及12h后純化DNA產量PFA溶液不同時間不同濃度來處理布魯氏桿菌與對照組一樣，都在500bp片段左右產生明亮的條帶。不同濃度（1%，2%和4%PFA）處理30min與12h后，與對照組相比，4%PFA總DNA濃度顯著，但30minPFA處理的DNA總量相比于對照組有所減少，所以用4%PFA處理布氏桿菌30min即可。