基于1H-NMR 的不同基因型煙草的差異代謝物分析

魏克強，楊俊仙，李娟娟，宋 欣

（1.山西大學生命科學學院，山西太原030006；2.山西大學經濟與管理學院，山西太原030006；3.保定幼兒師范高等專科學校，河北涿州072750）

目前，我國煙草種質的遺傳多樣性水平較低、遺傳基礎相對狹窄，限制了煙葉品質的進一步提高。通過遠緣雜交引進外源基因以改良品種、形成新物種和新類型已成為煙草育種的發展趨勢[1]。煙葉燃燒后釋放的煙氣富含4 800 余種化學成分，有1/3 直接來源于煙草本身，其余的是通過燃燒、裂解、蒸餾、冷凝等一系列復雜的物理化學過程新產生的[2]，因此，煙草內源性物質的含量及性質直接影響了卷煙制品的安全性與可用性。

基因型是影響煙草化學成分的主要因素之一。代謝產物是基因表達的終產物，代謝組學以相對分子質量1 000 以下的內源性小分子為研究對象，其種類和數量變化是生物系統對基因或環境變化的最終響應，日益成為遺傳育種、環境毒理、疾病診斷、藥物篩選等研究領域的熱點[3-4]。基于核磁共振（NMR）和質譜（MS）的代謝組學新技術，國內外已對植物野生種與栽培種、野生型與轉基因植株、品種間雜交后代的基因型差異進行了相關研究，表明這是一個有助于評價基因改造效果、篩選優良材料的方法[5-8]。魏克強等[9]利用分子標記和靶標分析技術揭示了導入白花曼陀羅（Datura metel L.）基因的煙草遠緣雜交新品種曼陀羅煙與普通煙草（Nicotiana tobacum L.）的基因型差異，發現莨菪烷型生物堿（東莨菪堿、阿托品）是其差異性代謝產物之一，但尚未對化學成分進行整體、全面的分析。基于此，山西大學生命科學學院環境污染與健康風險實驗室利用1H-NMR 技術結合主成分分析法（PCA）、正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）的多元統計方法，研究了曼陀羅煙及其親本煙草78-04 的差異代謝物，旨在為指導煙草品質的遺傳改良、構建煙氣毒理的評價方法提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

供試煙草遠緣雜交新品種曼陀羅煙及其親本烤煙品種78-04，由山西農業大學煙草育種研究室提供。MS 固體培養基（北京索來寶），NMR 試劑重水（美國Norell）；氘代甲醇、氘代氯仿（德國Merck）等。Bruker 600-MHz Avance ⅢNMR Spectrometer（德國布魯克公司），KDC-140HR 型高速冷凍離心機（安徽中科中佳），MGC-350HP 智能型人工氣候箱（上海一恒）等。

1.2 試驗方法

試驗于2018 年3—8 月在山西大學進行。

1.2.1 煙草幼苗的培養 挑選顆粒飽滿的種子，于培養皿中先用無菌水浸泡24 h，再用75%乙醇浸泡1 min，10%H2O2浸泡15 min，無菌水沖洗干凈后接種于MS 培養基上，暗培養至種子破皮后，人工氣候箱內進行光照培養（溫度26 ℃，濕度75%）。

1.2.21H-NMR 的檢測方法 參考文獻[10]的方法，煙草幼苗培養60 d 后，取新鮮的葉片組織，液氮研磨。真空冷凍干燥后，稱取200 mg，置于10 mL 的玻璃離心管中。加入蒸餾水和甲醇各1.5 mL、氯仿3 mL，室溫下漩渦混勻1 min。將混勻后的樣品置于超聲清洗儀中，超聲提取25 min；室溫下，3 500 r/min 離心25 min。取上清液，減壓濃縮蒸干，對上層甲醇水相濃縮蒸干物進行溶解處理：加入氘代甲醇400 μL與緩沖液400 μL 溶解，然后使用移液槍將圓底燒瓶中的溶液轉移至離心管，4 ℃，13 000 r/min 離心10 min。取上清液600 μL 于5 mm 核磁管內進行600-MHz NMR 檢測，參數為25 ℃，測定頻率為600.13 MHz，掃描次數為64，譜寬為12 345.679 Hz。

1.3 數據分析

將核磁圖導入MestReNova 軟件，對核磁圖進行定標（TSP：δ0.00），相位校準和基線校準后進行積分處理，以δ0.01 對積分區間進行分段積分，積分區段為δ0.76～9.34，切除其中甲醇峰δ3.29～3.32。將處理后的數據保存。使用SIMCA-P 13.0 軟件對上述處理的積分數據作PCA 和OPLS-DA 分析，找出樣品中的差異性代謝物。

2 結果與分析

對分離得到的提取物的核磁圖譜進行代謝物指認，根據文獻[7，11]提供的化合物化學位移、耦合常數以及核磁數據庫，從煙葉甲醇水相的圖譜中共指認出18 個代謝物，主要包括氨基酸類（亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、γ-氨基丁酸、天冬氨酸、色氨酸、酪氨酸、異亮氨酸、甘氨酸）、糖類（β-葡萄糖、α-葡萄糖、蔗糖）、有機酸類（延胡索酸、甲酸）、膽堿等物質。然后采用多元統計分析對數據進一步挖掘：在PCA 得分散點圖的基礎上建立OPLS-DA得分圖，以消除組內及隨機誤差，使得數據的整體特征和變化規律更加明顯，提高模型的有效性和解析力。篩選組間的差異性代謝物（圖1）：由得到的OPLS-DA 得分圖和S-PLOT 圖，同時結合S-PLOT 圖中VIP 值（＞1）尋找不同基因型煙草中的差異性代謝物，可見曼陀羅煙與78-04 能明顯區分，其化學成分差異主要涉及γ-氨基丁酸、β-葡萄糖、α-葡萄糖、脯氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、異亮氨酸、甘氨酸等代謝物，尤以氨基酸類最為明顯。

3 討論

在植物代謝組學研究中，核磁共振波譜技術（NMR）和色譜-質譜聯用技術（GC/MS 或LC/MS）是目前最常用的技術平臺，主要被應用于揭示植物對環境擾動代謝調控的生物標記物以及植物對遺傳改變的代謝應答、鑒別不同基因型材料的差異。基于GC/MS 的分析顯示，蘋果酸和檸檬酸是辨別不同基因型擬南芥（Arabidopsis thaliana）（Col0 和C24）最重要的代謝物，葡萄糖和果糖是辨別其雜交一代F1（C24×Col0 和Col0×C24）最重要的代謝物。基于1H-NMR 的代謝輪廓分析發現，色氨酸、甲酸、脯氨酸和蘇氨酸的含量差異與2 個基因型（褐色籽與黃色籽）埃塞俄比亞芥（Brassica carinata）的耐鹽性差異密切相關，為生物乙醇材料的篩選提供了依據。基于1H-NMR 的代謝指紋分析，確定了區分野生型與表達水楊酸生物合成基因薩姆遜煙草植株的主要成分是綠原酸、蘋果酸、葡萄糖和蔗糖；野生與栽培胡蘿卜（Daucus carota L.）幼苗的綠原酸、阿魏酰奎尼酸含量存在差異，并表明其雜種后代具有母本遺傳或野生品質優勢[5-8]。但這2 種方法各具優點和局限性，要對所有代謝產物進行無偏向性的完整分析，1H-NMR 與GC/MS 相結合將是比較理想的手段[12]。

茄科煙草屬（Nicotiana）植物的遺傳背景相對狹窄，栽培煙草品種間的遺傳相似性較高，迫切需要導入有價值的外源基因來拓展其基因池[13]。通常曼陀羅屬（Datura L.）植物被用于提取莨菪烷型生物堿，具有很高的醫藥價值。煙草的化學成分極其復雜，小分子代謝物的結構種類繁多、理化性質差異巨大、含量極微且動態范圍極寬、時空分布的差異明顯、相互作用方式多樣。燃燒后產生的煙氣成分更是復雜多樣，既有提供香氣、吃味和生理作用的物質，也有產生雜氣、刺激的物質，還有苯并芘、亞硝胺、煙堿等有害物質。筆者前期研究發現，基于國際煙草科學研究合作中心（CORESTA）推薦的毒理學測試方法，即細菌誘變分析（Ames 試驗）、細胞遺傳學分析（微核試驗）、哺乳動物細胞系細胞毒性分析（中性紅試驗）及大鼠慢性阻塞性肺疾病（COPD）模型，發現煙氣暴露誘發的體外毒性效應、大鼠吸煙相關性的肺損傷和COPD 的疾病進程等方面的差異可能與不同基因型煙草的差異性化學組成有關[14-17]。與78-04 比較，曼陀羅煙的總糖、還原糖、總氮和蛋白質含量分別降低19.24%，22.04%，6.34%和9.25%[9]。本研究進一步發現了18 個小分子的差異性代謝物，尤以氨基酸類最為明顯，但目前還不清楚它們對煙草品質、健康風險產生了哪些影響。傳統的育種方法預見性差、工作量大，難以快速獲得理想的類型，如何充分利用代謝組學信息來評價基因改造的效果、篩選出優良材料還有待于進一步研究。