可溶性程序性死亡分子配體1、結(jié)核菌素純蛋白衍生物及T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)聯(lián)合檢測對菌陰肺結(jié)核診斷的臨床價值

羅向波，文添博

（1.湖南省長沙市第一醫(yī)院 檢驗(yàn)科，湖南 長沙 410000；2.湖南省長沙健路醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司，湖南 長沙 410000）

肺結(jié)核屬于慢性傳染病，主要經(jīng)呼吸道傳播，是因?yàn)榉尾扛腥窘Y(jié)核桿菌所致，可累及諸多器官，嚴(yán)重危害著患者的安全健康。近些年來，我國肺結(jié)核患者越來越多，特別是痰菌陰性肺結(jié)核患者，在肺結(jié)核患者中大約占比70%左右［1］。故而盡早予以有效診斷，對患者預(yù)后改善意義重大。現(xiàn)階段，痰結(jié)核菌培養(yǎng)是臨床診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)，但此種方法所需時間較長且極易因?yàn)樘稻慷绊憴z查結(jié)果，所以對于早期結(jié)核病的診斷并不適用［2］。鑒于此，本文特此應(yīng)用可溶性程序性死亡配體 1 （soluble programmed death-ligand 1,sPDL1）、結(jié)核菌素純蛋白衍生物（purified protein derivative of tuberculin,TB-PPD）、結(jié)核感染T 細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)（T-SPOT.TB）聯(lián)合檢測，對菌陰肺結(jié)核患者進(jìn)行檢測診斷，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究組50 例菌陰肺結(jié)核患者中，男27 例，女 23 例；年齡 22～79 歲，平均（49.9±4.7）歲；常規(guī)組50 例非結(jié)核感染的肺病患者中，男28 例，女 22 例；年齡 21～79 歲，平均（49.5±4.4）歲。均收治于2018年2月至2019年2月。兩組臨床資料均衡一致（P＞0.05），可分組探討。研究對象均在知情情況下進(jìn)行觀察。

1.2 方法

抽取空腹外周靜脈血10 ml，分成兩份各5 ml，其中一份予以肝素抗凝處理之后，離心，對外周血單核細(xì)胞進(jìn)行分離，另一份離心之后摒棄上層清液，存儲于-80℃環(huán)境下待檢。通過酶聯(lián)免疫吸附 實(shí) 驗(yàn) （enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）法測定血清sPD-L1 水平。TB-PPD 檢測診斷：選取PPD 稀釋液0.1 ml，注入到觀察對象的左前壁內(nèi)側(cè)上方1/3 處，局部形成皮丘，3 d 后觀察局部反應(yīng)，并對局部硬結(jié)大小進(jìn)行測量。T-SPOT.TB 檢測診斷：選擇Immunotec 公司所生產(chǎn)的試劑盒，按說明書進(jìn)行嚴(yán)格操作，記錄斑點(diǎn)數(shù)量。

1.3 觀察指標(biāo)

sPD-L1 陽性標(biāo)準(zhǔn)：超過1.33 ng/ml 時，視為陽性。TB-PPD 陽性標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)硬結(jié)測量結(jié)果進(jìn)行評定，大小＜5 mm 視為陰性，5～9 mm 視為弱陽性，10～19 mm 視為陽性，20 mm 及以上且局部水泡、壞死比較明顯，視為強(qiáng)陽性。T-SPOT.TB 陽性標(biāo)準(zhǔn)：1 個效應(yīng)T 細(xì)胞=1 個斑點(diǎn)，若是無反應(yīng)對照孔斑點(diǎn)數(shù)有0～5 個，而且無反應(yīng)對照孔斑點(diǎn)計數(shù)量與抗原B 或抗原A 斑點(diǎn)數(shù)之間的差距大于5 時，視為陽性；如果無反應(yīng)對照孔的斑點(diǎn)數(shù)存在6～10 個，且抗原B 或抗原A 斑點(diǎn)數(shù)＞兩倍時，視為陽性。

3 項(xiàng)指標(biāo)中若是任一項(xiàng)表現(xiàn)為陽性，則視為sPD-L1+TB-PPD+T-SPOT.TB 為陽性；若是3 項(xiàng)均為陽性，則視為sPD-L1＊TB-PPD＊T-SPOT.TB呈陽性。ROC 曲線的評價方法與傳統(tǒng)的評價方法不同，無須此限制，而是根據(jù)實(shí)際情況，允許有中間狀態(tài)，可以把試驗(yàn)結(jié)果劃分為多個有序分類，如正常、大致正常、可疑、大致異常和異常5 個等級再進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析兩組研究數(shù)據(jù)，計數(shù)資料以百分比（%）表示，予以χ2檢驗(yàn)；計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，予以t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清sPD-L1含量對比

研究組血清sPD-L1 含量為（3.5±0.2）ng/ml，常規(guī)組血清sPD-L1 含量為（0.8±0.1）ng/ml，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=85.381,P＜0.05）。

2.2 聯(lián)合檢測診斷與單獨(dú)檢測診斷的臨床價值

聯(lián)合 sPD-L1、TB-PPD、T-SPOT.TB 檢測診斷菌陰肺結(jié)核的特異性、敏感性、接收器工作特性（receiver operating characteristic,ROC）曲線下面積、約登指數(shù)均優(yōu)于單獨(dú)一種檢測指標(biāo)。見表1。

表1 聯(lián)合檢測診斷與單獨(dú)檢測診斷的結(jié)果對比

3 討論

菌陰肺結(jié)核在結(jié)核病患者中大約占比70%左右，傳染性較強(qiáng)，可引起35%左右的結(jié)核菌經(jīng)呼吸道傳染，且隨訪觀察1～3年，可發(fā)現(xiàn)菌陰肺結(jié)核的痰菌轉(zhuǎn)陽風(fēng)險高達(dá)40%～60%，對患者的安全健康造成了嚴(yán)重的影響。基于此，盡快確診菌陰肺結(jié)核，以切斷疾病傳染源，臨床意義十分重大。菌陰肺結(jié)核的病理學(xué)、細(xì)菌學(xué)證據(jù)并不明顯，這在一定程度上增大了臨床診斷難度，極易導(dǎo)致臨床誤診/漏診。故而需積極探索一種全新的診斷方式準(zhǔn)確、快速確診菌陰肺結(jié)核。臨床診斷菌陰肺結(jié)核主要有結(jié)核菌素試驗(yàn)、胸部影像學(xué)診斷、纖維支氣管鏡檢查、肺部組織病理學(xué)檢查、結(jié)核桿菌細(xì)菌學(xué)檢查以及診斷性抗結(jié)核治療等［3］，上述方法因?yàn)樘禺愋浴⒚舾行郧芳眩蛘呤且驗(yàn)椴蝗菀兹〔亩谂R床應(yīng)用中受限［4］。

結(jié)核分枝桿菌感染后，會產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)，機(jī)體初次感染后會生成效應(yīng)T 細(xì)胞，二次感染后，因?yàn)榻Y(jié)核桿菌特異性抗原所產(chǎn)生的刺激，使T 細(xì)胞快速活化、增殖，釋放、分泌諸多細(xì)胞因子，尤其是干擾素-γ［4］。通過檢測干擾素-γ 含量，有助于臨床了解患者機(jī)體感染分支桿菌后的細(xì)胞免疫應(yīng)答情況，輔助臨床診斷結(jié)核病。sPD-L1 為生物學(xué)標(biāo)志物，在機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答中有參與作用，經(jīng)干擾素-γ 誘導(dǎo)，可使T 細(xì)胞表達(dá)sPD-L1，與PD-1 受體結(jié)合后，可對T 細(xì)胞功能進(jìn)行抑制，負(fù)性調(diào)控T 細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)。ELISA法檢測sPD-L1 簡單方便，本文發(fā)現(xiàn)，研究組sPD-L1 高于常規(guī)組 （P＜0.05），這是因?yàn)?T 細(xì)胞受到結(jié)核桿菌特異抗原刺激，進(jìn)而生成諸多sPDL1 所致。單純用sPD-L1 檢測診斷菌陰肺結(jié)核的特異性82.00%、敏感性為44.00%，臨床應(yīng)用受限。TB-PPD 檢測診斷操作簡單，在臨床篩查肺結(jié)核患者中比較常見，但由于非結(jié)合分支桿菌與卡介苗、存蛋白衍生物的部分抗原成分相同，故而極易引起假陽性結(jié)果［5］。本文用TB-PPD 檢測診斷菌陰肺結(jié)核的特異性60.00%、敏感性為66.00%，單純診斷難度較大［6］。T-SPOT.TB 為干擾素-γ 釋放試驗(yàn)，基于T 細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)，以抗原靶6、濾液蛋白10 為體外刺激物，能夠進(jìn)一步提高臨床診斷菌陰肺結(jié)核的敏感性［7］。本文用T-SPOT.TB 檢測診斷菌陰肺結(jié)核，結(jié)果發(fā)現(xiàn)特異性為92.00%、敏感性為84.00%。提示T-SPOT.TB檢測診斷在臨床應(yīng)用中具有較高的價值。就單獨(dú)某一種指標(biāo)檢測而言，T-SPOT.TB 檢測診斷的陽性率要顯著高于TB-PPD、sPD-L1，說明T-SPOT.TB 診斷菌陰肺結(jié)核的臨床意義重大［8］。現(xiàn)階段，在臨床診斷肺結(jié)核中，T-SPOT.TB 應(yīng)用依然受限，雖然能確定患者有無感染，但是對于潛伏期、活動期感染的區(qū)分具有一定的難度。為提高臨床檢測診斷的有效性，臨床一般聯(lián)合應(yīng)用兩個或者是兩個以上的指標(biāo)進(jìn)行檢測診斷［9］。本文觀察發(fā)現(xiàn)，TB-PPD+sPD-L1+T-SPOT.TB 的特異性為66.00%、敏感性為96.00%，相比于單項(xiàng)指標(biāo)檢測結(jié)果而言，敏感性更高，但特異性偏低；而TB-PPD＊sPDL1＊T-SPOT.TB 的特異性為96.00%、敏感性為46.00%，相比于單項(xiàng)指標(biāo)檢測結(jié)果而言，特異性更高，但敏感性偏低。

總之，對于菌陰肺結(jié)核的診斷，聯(lián)合應(yīng)用TB-PPD、sPD-L1 及T-SPOT.TB 檢測診斷價值更高，值得在臨床中大力推薦［10］。