基于ISSR標記的大花三色堇遺傳多樣性分析

段 磊，王 霞，王夢圓，宋亞男

（吉林農業科技學院，吉林吉林 132101）

大花三色堇（Viola × wittrockiana.Gams.）又名貓臉花、蝴蝶花，其品種豐富、花色艷麗、抗凍性強等優點，深受人們喜歡，并被譽為“花壇皇后”。大花三色堇在歐洲、美國和日本非常盛行，這些國家自19世紀便開始了大花三色堇的品種選育工作，現已取得了顯著的成效，培育出了多種新奇的優良品種[1]。而我國針對大花三色堇品種選育方面的研究尚處于起步階段，栽種的多為進口F1代種子，這些種子不僅成本高，而且對我國生境的適應能力差，因此，隨著市場需求量的增加，選育適應中國生境、植株健壯、抗性強、具有中國知識產權的優良品種已是當務之急。

種質資源遺傳多樣性研究是進行新品種選育的重要內容。目前，我國針對大花三色堇遺傳多樣性方面的研究較少，僅有2例DNA分子標記方面研究的報道[1，2]，尚無利用簡單序列重復區間擴增（inter-simple sequence repeat，簡稱ISSR）技術研究大花三色堇種質資源分類方面的報道。本試驗利用ISSR技術分析24份大花三色堇材料的遺傳多樣性分析，為大花三色堇優良種質資源的收集、分類和良種繁育奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

24份供試材料分別購自甘肅酒泉金秋園藝種業有限公司、美國泛美種子公司、英國弗倫諾瓦公司和北京花仙子農業有限公司（見表1）。

將種子消毒后接種于不添加任何激素的MS培養基中進行無菌培養，至三葉期取其葉片，于-20℃冷凍保存，備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取

參照王健[2]的方法，采用改良的SDS法提取大花三色堇葉片基因組DNA，然后分別利用核酸分析儀和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的純度和濃度，稀釋DNA濃度至50 ng/μl，-20 ℃貯存備用。

1.2.2 試劑

taq DNA聚合酶、dNTPs、SDS等藥品均購自北京全式金生物技術有限公司，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

注：a：甘肅酒泉金秋園藝種業有限公司；b：美國泛美種子公司；c：英國弗倫諾瓦公司；d：北京花兒朵朵花仙子農業有限公司。

1.2.3 ISSR-PCR擴增

在前期試驗的基礎上，選用10條擴增條帶清晰、穩定、多態性強的引物擴增24份材料的基因組DNA，20μl的ISSRPCR反應體系，包括Mg2+2.5 mmol·L-1、Taq DNA聚合酶1.2U、dNTPs 0.2 mmol·L-1、引物0.4 umol·L-1、DNA模板50ng。擴增程序為：94 ℃預熱5 min；94 ℃變性40s，51℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，39個循環；72 ℃再延伸10 min；4℃保溫。擴增產物用2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測分析。

1.2.4 數據處理及分析

統計擴增條帶，有帶記為1，無帶記為0，建立0、1矩陣圖，利用NTSY-pc2.1軟件計算不同樣品間的遺傳相似系數，并作聚類分析。

2 結果與分析

2.1 基因組DNA質量檢測

24份材料基因組DNA的電泳條帶清晰、明亮、無拖尾現象，核酸分析儀檢測顯示OD260/OD280值均在1.8-1.9范圍內，DNA質量濃度在155-295 ug/mL范圍內，所提基因組DNA純度較高，可用作ISSR分析。

2.2 ISSR-PCR擴增結果多態性分析

10條引物擴增24份材料樣品基因組DNA，擴增總片段數為91，其中多態性條帶數為79，多態性比率為86.81%。

2.3 聚類分析

將24份材料基因組DNA 的擴增條帶轉化為0、1二元矩陣圖，計算遺傳相似系數，并在此基礎上構建 UPGMA 聚類圖，結果如圖1所示，可知在遺傳相似系數0.44處，24份材料可以分為2大類群，分別是美國泛美的XXL-YB和英國弗倫諾瓦的PAN575R聚為I類，其余為第II類，遺傳相似系數為0.47時，第II類又可以分為2個亞類，其中酒泉金秋園藝公司的229.04與美國泛美種子公司的M-YC為A亞類，酒泉金秋園藝公司的其余品種與花仙子農業公司的2個品種為B亞類，且B亞類中顏色相近者、同一系列品種多聚在一起，可見，材料地理來源、顏色以及品系是影響大花三色堇遺傳多樣性的重要因素。

圖1 24份大花三色堇的ISSR聚類圖

3 討論

ISSR技術是顯性標記，它結合了RAPD的優點，同時克服了RAPD、SSR、RFLP等技術的缺點，不需要預先知道靶標DNA序列，具有高效、快速、穩定、易操作、成本低等優點，現已廣泛用于指紋圖譜構建、親緣關系鑒定、遺傳多樣性分析等領域[3]。本研究通過分析24份大花三色堇材料的遺傳多樣性，發現國內材料遺傳距離較近，結果同RAPD標記[2]和基于主成分的聚類分析[4]結果一致，說明現有國內栽培品種來源相近，種質交流受地域限制，這可能是由于大花三色堇的優良品種多為歐美、德國和日本等國研發，這些國家為了保護自身利益，限制了國際間的流通品種而造成的。為滿足我國大花三色堇的市場需求，必須加快大花三色堇新品種選育的步伐。研究中還發現，花色與品系是影響大花三色堇遺傳距離的重要因素，尤以花色最為明顯，故可以推測不同花色的遺傳基礎是不同的。