PHLPP2與Akt表達對NSCLC紫杉醇耐藥的臨床意義

林玲 陳美芳 呂冬青 葛宏飛

[摘要] 目的 研究PHLPP2在紫杉醇耐藥非小細胞肺癌組織中的表達及其與Akt表達的關系。 方法 采用免疫組化方法分別檢測160 例非小細胞肺癌組織中的PHLPP2、Akt表達，分析PHLPP2在紫杉醇耐藥組和非耐藥組非小細胞肺癌組織細胞中的表達高低及其與Akt表達的關系。 結果 （1）PHLPP2在低中分化肺癌組織內的陽性表達為39.8%，高分化肺癌組織內的陽性表達為70.2%，兩者表達存在顯著性差異（χ2=13.539，P<0.001）。（2）Akt在Ⅳ期的陽性表達為77.0%，在Ⅲb期的陽性表達為56.7%，兩者表達存在顯著性差異（χ2=7.297，P<0.05）。在淋巴結轉移的陽性表達為83.3%，在無淋巴結轉移的陽性表達為44.8%，兩者表達存在顯著性差異（χ2=25.804，P<0.001）。在不同的分化程度、性別、年齡、腫瘤最大直徑、組織學類型的表達差異均無顯著性（P>0.05）。（3）PHLPP2表達在TP方案耐藥組中低表達率高于非耐藥組，差異有統計學意義（P=0.043）。（4）Akt表達在TP方案耐藥組中高表達率高于非耐藥組，差異有統計學意義（P=0.022）。 結論 PHLPP2可能通過調節Akt水平減少NSCLC對紫杉醇治療的耐藥性。

[關鍵詞] PHLPP2;Akt; 肺癌; 紫杉醇;耐藥

[中圖分類號] R734.2? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）17-0028-04

[Abstract] Objective To study the expression of PHLPP2 in paclitaxel-resistant non-small cell lung cancer and its relationship with Akt expression. Methods Immunohistochemistry was used to detect the expression of PHLPP2 and Akt in 160 non-small cell lung cancer tissues. The expression of PHLPP2 in paclitaxel-resistant and non-resistant NSCLC tissues， and its relationship with the expression of Akt were analyzed. Results （1）The positive expression of PHLPP2 was 39.8% in poor and middle-differentiated lung cancer tissues， and 70.2% in well-differentiated lung cancer tissues. There was significant difference between the two expressions（χ2=13.539， P<0.001）. （2）The positive expression of Akt in the stage Ⅳ group was 77.0%， and the positive expression in the stage Ⅲb group was 56.7%. There was a significant difference between the two groups（χ2=7.297， P<0.05）. The positive expression of Akt was 83.3% in the lymph node metastasis group and 44.8% in the no lymph node metastasis group. There was a significant difference between the two groups（χ2=25.804， P<0.001）. There were no significant differences in tumor maximum diameter and the expression levels of histological type between different differentiation groups， gender groups， age groups（P>0.05）. （3）The low expression rate of PHLPP2 expression in the TP regimen resistant group was higher than that in the non-resistant group （P=0.043）. （4） The high expression rate of Akt expression in the TP regimen resistant group was higher than that in the non-resistant group， with significant difference（P=0.022）. Conclusion PHLPP2 may reduce the resistance of NSCLC to paclitaxel treatment by regulating Akt levels.

[Key words] PHLPP2; Akt; Lung cancer; Paclitaxel; Drug resistance

肺癌為人類最常見的惡性腫瘤，大多患者在確診時已經是晚期，化療是晚期非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的主要治療手段。紫杉醇為肺癌常用的化療藥物之一，但是化療耐藥一直是導致其治療失敗的主要原因，也是目前治療的難點[1]。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是PI3K/AKT/mTOR信號通路中重要的信號轉導蛋白，有研究證實[2]Akt活化與肺癌細胞對紫杉醇的耐藥有關。PHLPP（PH domain leucine-rich repeats protein phosphatase）是一個新的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶，其所編碼的PHLPP蛋白可以脫下Akt疏水基團的磷酸分子，使Akt失活，成為Akt的負調節物[3]。PHLPP2為PHLPP家族的同工酶之一。為探索PHLPP是否可通過調節Akt水平以減少NSCLC對紫杉醇治療的耐藥性，本實驗以 PHLPP2和Akt為觀察指標，通過檢測紫杉醇耐藥組和非耐藥組NSCLC組織中免疫組化表達變化，觀察PHLPP2和Akt兩者的關系及與紫杉醇耐藥發生的相關性。

1 材料與方法

1.1材料來源

2015年1月～2017年12月本院病理組織庫采集的160例非小細胞肺癌均經病理診斷明確。其中男100例，女60例，年齡43～72歲，平均55.3歲，鱗癌80例，腺癌80例。依據 2009 年國際肺癌研究會（IASLC）第7版肺癌TNM 分期標準[4]，其中Ⅲb期60例，Ⅳ期100例。高分化57例，中低分化103例。標本為肺癌組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋。所有病例均有可評價病灶，全身功能狀態（ECOG）評分≤2分。

1.2 方法

隨機分為兩組，每組各80例。試驗組給予紫杉醇/順鉑（TP）方案：順鉑25 mg/（m2·d），靜滴，第1～3天，21 d為一個周期;紫杉醇175 mg/m2，靜滴，第1天。2個周期后評價療效。對照組給予吉西他濱/順鉑（GP）方案：吉西他濱1 g/m2，靜滴，第1天、第8天;順鉑25 mg/（m2·d），靜滴，第1～3天，每3周1次。2個周期后評價療效。PHLPP2與Akt免疫組化測定采用PowerVision二步法，按試劑盒說明書進行操作。已知PHLPP2與Akt陽性的癌組織作為陽性對照，PHLPP2與Akt蛋白免疫組化陽性細胞判定標準，參照文獻[6]由一名高年資病理科主任醫師與一名高年資病理科主治醫師雙盲法統計結果。陽性表達呈棕黃色顆粒染色，主要定位于胞漿內。在癌巢組織中，計算陽性癌細胞數占總癌細胞數的百分比，陽細胞≥25%為陽性，<25%為陰性。染色結果根據著色強度用四分層進行計數（陰性=0，最弱=1，中度=2，強=3）。0～1分為低表達，2～3分為高表達。

1.3 主要試劑

抗PHLPP2兔單克隆抗體（貨號：ARG53458）規格：100 μL、抗Akt兔多克隆抗體（貨號：ARG56418）規格：50 μL，均由臺灣arigo公司提供，2℃～8℃ 儲存。

1.4 療效判定標準

化療2個療程結束后按照RECIST1.1評價標準判定[5]。淋巴結短軸值> 15 mm是可測量病灶。CR：所有靶病灶完全消失，病理性淋巴結短軸值<1.0 cm;PR：靶病灶最大長徑之和在4周內持續減少 30.0%以上;PD：最大長徑之和增加20.0%以上或有新病灶出現;SD：目標病灶最大長徑之和減少低于30.0%或增加不足20.0%。以取得CR或PR為化療敏感，否則為耐藥。

1.5 統計學方法

采用SPSS 20.0統計學軟件包進行統計分析，蛋白表達與臨床病理指標關系采用χ2檢驗，兩蛋白表達之間的比較采用Spearman等級相關檢驗進行分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PHLPP2與Akt的表達及與臨床病理參數間的關系

PHLPP2陽性表達呈棕黃色顆粒染色，主要定位于胞漿內，細胞間隙也可見其陽性染色，見封三圖1。Akt陽性表達呈棕黃色顆粒染色，主要定位于胞漿內，細胞間隙也可見其陽性染色，見封三圖2。根據免疫組化結果判斷標準，160例肺癌組織內PHLPP2陽性表達81例，陽性率為50.6%，肺癌組織內Akt陽性表達111例，陽性率為69.4%，見表1。PHLPP2在低中分化肺癌組織內的陽性表達為39.8%，高分化肺癌組織內的陽性表達為70.2%，兩者表達存在顯著性差異（χ2=13.539，P<0.001）;在不同的性別、年齡、腫瘤最大直徑、TNM分期、組織學類型、淋巴結有無轉移的表達差異均無顯著性（P>0.05）。Akt在Ⅳ期的陽性表達為77.0%，在Ⅲb期的陽性表達為56.7%，兩者表達存在顯著性差異（χ2=7.297，P<0.05）;在淋巴結轉移的陽性表達為83.3%，在無淋巴結轉移的陽性表達為44.8%，兩者表達存在顯著性差異（χ2=25.804，P<0.001）;在不同的分化程度、性別、年齡、腫瘤最大直徑、組織學類型的表達差異均無顯著性（P>0.05）。

2.2 PHLPP2與Akt在TP與GP化療方案耐藥及非耐藥組中表達程度及相關性

PHLPP2表達在TP方案耐藥組中低表達率高于非耐藥組，差異有統計學意義（P=0.043<0.05）;Akt表達在TP方案耐藥組中高表達率高于非耐藥組，差異有統計學意義（P=0.022<0.01）。見表2。PHLPP2與Akt表達在GP方案耐藥組與非耐藥組中差異無統計學意義（P>0.05）。見表3。

3 討論

紫杉醇作為一種微管靶向抗腫瘤藥物，為肺癌常用的化療藥物之一，在肺癌治療上具有良好的療效而廣泛使用，但是腫瘤細胞對紫杉醇產生耐藥是治療失敗的重要原因[7]。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，是PI3K/Akt信號轉導通路的核心因子，在腫瘤的發生發展中發揮重要作用。有研究證實Akt信號通路與多種腫瘤的化療耐藥和預后有關[8，9]，PI3K/Akt/mTOR信號通路在惡性腫瘤發生、侵襲、轉移及化療耐藥中具有重要的影響，其作用主要是促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，促進腫瘤血管生成[10-12]。在肺癌組織中，Akt信號通路被明顯活化，并且P-Akt呈現高表達[13]。國內研究[14]顯示紫杉醇耐藥肺癌A549細胞（A549/T細胞）在用 AS1411處理后Akt的蛋白水平均有下調，細胞的活性與克隆形成能力都受到抑制，同時細胞凋亡數目增加，該研究提示Akt的活化與肺癌細胞對紫杉醇的耐藥有關。體外試驗研究[15]證明了紫杉醇能激活ERK1/2通路誘導大腸癌細胞凋亡。PHLPP 是一個新的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶，PHLPP2基因定位于16號染色體，是PHLPP家族中三個同工酶中的其中一個。Gao等[3]2005年發現其所編碼的PHLPP蛋白可以脫下Akt的疏水基團Ser473位點一個磷酸分子，PHLPP蛋白可以脫下Akt的疏水基團Ser473位點一個磷酸分子，使Akt失活，拮抗細胞內P13K/Akt信號通路，具有抑制腫瘤細胞生長與遷移能力，促進細胞凋亡的作用，證實其為腫瘤抑制基因的角色。

PHLPP已經被證明能使Akt脫去磷酸后失去活性，從而成為Akt的負調節物[16]。有研究在H157細胞（NSCLC細胞）和乳腺癌細胞發現PHLPP的超表達導致Akt活性降低，使得細胞凋亡增加，然而PHLPP的敲除使得Akt活性增加，使得細胞凋亡減少[17]。同時發現PHLPP在慢性淋巴細胞白血病、乳腺癌、惡性膠質瘤、黑色素瘤呈現低表達，并且惡性膠質瘤患者的PHLLP表達越高，其存活率也越高[18]。在結腸癌的研究中也證實了PHLPP是一種腫瘤抑制因子，J Liu等報道了PHLPP二個同工酶在結腸癌標本和臨近正常組織中免疫組化的表達，發現PHLPP1和PHLPP2在腫瘤組織中丟失或者減少分別是78%和86%，同時PHLPP在結腸癌細胞的超表達能減少細胞增殖，并且通過抑制Akt信號通道能很大程度地抑制細胞生長[19]，從而表明PHLPP參與腫瘤生長的負性調節作用，提示PHLPP作為腫瘤抑制因子將有可能用于Akt水平升高的癌癥治療。PHLPP2通過PI3K/Akt信號傳導通路抑制細胞周期進展并促進肺癌細胞的凋亡[20]，但PHLPP2在肺癌組織中的表達譜尚不清楚。研究已確定 PHLPP2基因是終止致癌Akt信號傳導特異性和有效的必需磷酸酶[21]。

本研究發現PHLPP2在低中分化肺癌組織內的陽性表達率較高分化的表達低，提示PHLPP2的低表達可能促進腫瘤的惡性分化程度。Akt在Ⅳ期的陽性表達較Ⅲb期高，和肺癌晚期腫瘤分期相關。Akt陽性表達和有無淋巴結轉移亦存在相關性，與研究一致[22-24]，考慮Akt的高表達與腫瘤細胞的侵襲和轉移有關。PHLPP2表達在TP方案耐藥組中低表達率明顯高于非耐藥組，Akt表達在TP方案耐藥組中高表達率明顯高于非耐藥組，而PHLPP2與Akt表達在GP方案耐藥組與非耐藥組中表達無統計學差異。

綜上所述，我們認為Akt的活化與肺癌細胞對紫杉醇的耐藥可能有關，PHLPP2可能通過調節Akt水平減少NSCLC對紫杉醇治療的耐藥性。該研究局限于病理組織，本團隊將進一步探索在細胞學方面的耐藥機制試驗。

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（收稿日期：2019-03-18）