晚期糖基化終末產物受體、核轉錄因子在小鼠急性肝衰竭中的作用

張留魯 邵和軍

(貴州省人民醫院感染科，貴州 貴陽 550002)

急性肝功能衰竭具有起病急、預后差及病死率高的特點，經過多年的研究，現已證實以單核細胞、巨噬細胞、淋巴細胞等免疫細胞動員和白介素1(interleukin-1，IL-1)、白介素6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)多種炎性因子的過度釋放為代表的免疫系統過度活化在急性肝功能衰竭過程中發揮重要作用[1]。晚期糖基化終末產物受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)是一種模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)，可表達于淋巴細胞、單核細胞、淋巴細胞等多種免疫細胞，參與調節免疫應答[2]。核轉錄因子(Nuclear factor kB，NF-κB) 是許多炎癥細胞因子基因的啟動因子，可以有效誘導炎癥因子、趨化因子、炎性酶等的基因轉錄表達，對炎癥反應級聯放大，可在多種炎癥性疾病的炎癥部位高度活化，NF-κB在炎癥反應中起著主要作用，RAGE與配體結合后可激活細胞絲裂原活化蛋白激酶途經，啟動活化核因子NF-κB，介導炎性因子的產生，形成持續性的炎癥活化正反饋作用，因此，RAGE激活后不僅參與炎癥反應，還可加強持續炎癥反應并且導致炎癥反應慢性化。

1 材料與方法

1．1 材料及實驗方法 雄性昆明種SCXK(黔)2012-001小鼠40只，體質量(20±1.7) g。適應性喂養3 d后，隨機分為：正常對照組(n=8只)，肝衰竭模型4 h組(n=8只)、8 h組(n=8只)、12 h組(n=8只)及24 h組(n=8只)。急性肝衰竭模型復制：新鮮配制D-氨基半乳糖及LPS溶液(用生理鹽水將D-氨基半乳糖及LPS配成D-GalN50 mg/mL、LPS1 μg/mL)，按D-GalN500 mg/kg、LPS10 μg/kg的劑量腹腔注射一次。肝衰竭組在建模后4 h、8 h、12 h和24 h(實驗中18 h后死亡小鼠計入24 h組)眼球取血后斷頸處死各組小鼠，留取血液及全部肝臟。血液4 ℃離心1 500 rpm×10 min后，分離血清，置-80 ℃冰箱保存。取各小鼠右葉肝組織1.3 mm3大小于4%中性甲醛固定，其余肝組織置-80 ℃冰箱保存。

1.2 檢測指標及方法

1.2.1 血清ALT、AST、TBIL含量檢測 血清ALT、AST、TBIL含量測定采用Siemens Advia 1650全自動生化分析儀，由貴州省人民醫院生化科嚴格按照試劑盒要求測定。

1.2.2 光鏡下觀察肝臟組織結構 肝右葉組織浸于4%中性甲醛緩沖液中固定48 h以后，轉移到0.1 mol/L的PBS溶液中保存，常規石蠟包埋切片行HE染色.

1.2.3 免疫組織化學檢測晚期糖基化終末產物受體、核轉錄因子蛋白的表達：采用SP法，微波加熱抗原修復，以二氨基聯苯胺(DAB)顯色。兔抗人RAGE、NF-κB單克隆抗體(武漢博士德生物技術公司)。操作程序按說明書進行。陰性對照以PBS替代一抗，用已知陽性標本作陽性對照。染色結果判斷：光鏡下觀察細胞呈棕黃色為陽性表達細胞，每張切片在高倍鏡下隨機取5個視野，分別按染色深度和陽性細胞的分布作如下評分：(1)無著色為 0 分，淡黃色為 1 分，棕黃色為 2 分，棕褐色為 3 分；(2)陽性范圍：沒有陽性細胞為 0 分，陽性細胞百分比<10%為 1 分，陽性細胞百分比11%～50%為2 分，陽性細胞百分比51%～80%為 3 分，陽性細胞百分比>80%為 4 分。以二者分數乘積，通過兩者乘積結果進行半定量統計。

1.2.4 熒光實時定量PCR 肝臟組織50 mg加入Trizol 1.0 mL充分勻漿后離心，取上清液，酶標儀測定RNA濃度。進行逆轉錄，逆轉錄20 μL體系(5×buffer 4 μL、10 mmol /L dNTP 2 μL、Olig DT 1 μL、RNase Inhibitor1 μL、RNA 反轉錄酶1 μL、RNase-free H2O 9.0 μL、模板2 μL); 逆轉錄條件：42 ℃ 60 min、70 ℃ 5 min、4 ℃保存; RT-PCR 20 μL 體系(2 ×SYBR Green 10 μL、primer mix 1.0 μL、RNase-freeH2O 7.0 μL、模板2.0 μL); 循環參數：50 ℃ 120 s、95 ℃ 10 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s ，共40 個循環。RAGE引物序列上游5’-CAGTCAGAGGAAGCGGAGAT-3’，下游5’-CTGGTTGGAGAAGGAAGTGC-3’ ；NF-KBp65引物序列上游5’-GACCTGGAGCAAGCCATTAG-3’，下游5’-ACTGTCACCTGGAAGCAGAG-3’。β-actin 序列：上游5’-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3’，下游5’-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3’。所有引物均采用Primer 3.0 設計并經過NCBI Blast 驗證產物特異性。

2 結 果

2.1 各組小鼠血清ALT、AST、TBIL濃度 小鼠注射D-GalN+LPS后，模型組AST、ALT濃度逐漸升高，12 h達高峰，24 h維持在較高水平，模型組小鼠血清AST、ALT濃度顯著高于正常對照組小鼠(P<0.01)；肝衰竭組小鼠血清TBIL濃度逐漸升高，24 h達高峰，肝衰竭組8 h、12 h、24 h組小鼠血清TBIL濃度高于正常對照組小鼠(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠血清ALT、AST、TBIL濃度

注：與對照組相比，#P<0.01，※P<0.05。

2.2 各組小鼠肝組織學變化 正常對照組小鼠肝小葉結構完整。模型組隨著給藥時間延長，肝組織的病理改變逐漸加重， 4 h時肝細胞輕度腫脹，嗜酸性變、炎細胞浸潤，可見核內包涵體，肝細胞呈點狀壞死；8 h時肝細胞氣球樣變，匯管區及肝細胞間見炎細胞浸潤伴出血，可見核內包涵體，肝細胞呈橋接壞死；12 h時可見肝細胞片狀壞死融合，核溶解、碎裂，匯管區及肝細胞間見較多炎細胞浸潤伴少量出血；24 h時肝細胞壞死更加明顯，大片狀壞死和少量出血，僅少量肝細胞殘存，散在分布，纖維網狀支架塌陷。見圖1。

圖1 各組小鼠肝組織HE染色結果

2.3 免疫組化檢測各組小鼠肝組織中RAGE、NF-κBp65蛋白表達變化 RAGE蛋白表達：正常對照組小鼠肝組織中很少表達。肝衰竭4 h組炎細胞及肝竇內皮細胞胞漿低表達， 8 h、12 h組表達呈陽性，炎性浸潤區陽性細胞胞漿表達明顯增加，24 h組，壞死區炎細胞陽性表達。NF-κBp65 蛋白表達：正常對照組主要為肝細胞染色陽性，細胞胞漿有弱表達。肝衰竭4 h組核陽性表達的細胞數明顯增多，8 h組、12 h組表達呈肝細胞胞漿強陽性，肝竇內皮細胞和炎細胞胞漿有陽性表達，隨著肝細胞壞死的加重， 24 h組陽性細胞表達減少，壞死區陽性表達明顯增加。經檢驗，模型8 h、12 h、24 h組RAGE蛋白、NF-κBp65 蛋白表達較正常對照組差異具有顯著統計學意義(P<0.01)。見圖2、圖3；

正常組(SABC，×400)

注：箭頭所示為陽性表達。

圖2 各組小鼠肝組織中RAGE蛋白表達結果

注：箭頭所示為陽性表達。

圖3 各組小鼠肝組織中NF-κBp65蛋白表達結果

2.4 各組小鼠肝組織中RAGEmRNA 、NF-kBp65mRNA表達水平 建模后肝衰竭組RAGEmRNA表達開始上調，持續升高，24 h達到高峰，經檢驗，肝衰竭組8 h、12 h、24 h組RAGEmRNA的表達較正常組增加(P<0.05)； 建模后肝衰竭組NF-kB65 mRNA水平表達開始上調，12 h達到高峰，24 h維持在較高水平，經檢驗，肝衰竭組8 h、12 h、24 h組NF-kBp65 mRNA的表達較正常組明顯增加(P<0.05)。見表2。

表2 小鼠肝組織中RAGEmRNA 、NF-kBp65mRNA表達

注：與對照組相比，※P<0.05。

3 討 論

急性肝功能衰竭(acute liver failure，ALF)可由包括藥物、毒物、病毒感染等多種原因引起，病理生理學上表現為肝細胞大量壞死、凋亡，導致肝臟合成、解毒、轉運和生物轉化等功能發生嚴重障礙，繼而出現以嚴重消化道癥狀、極度乏力、凝血功能障礙、深度黃疸、肝性腦病、腹水等臨床癥候群[3]。

RAGE 是細胞表面分子中免疫球蛋白超家族的一員，在體內分布非常廣泛，可表達于血管內皮細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、肝星狀細胞等[4-5]。Harashima等應用免疫組化技術發現，在肉芽腫性炎癥、吸煙相關性氣道疾病、間質性肺炎等幾種持續性炎癥性肺病的患者肺內RAGE蛋白表達增強[6]，RAGE激活后不僅參與炎癥反應，還可加強持續炎癥反應并且導致炎癥反應慢性化。

NF-κB是許多炎癥細胞因子基因的啟動因子，可以有效誘導炎癥因子、趨化因子、炎性酶等的基因轉錄表達，對炎癥反應級聯放大，在多種炎癥性疾病的炎癥部位高度活化，因此在炎癥反應中起著主要作用。研究證實RAGE與配體結合后形成的復合物可激活細胞絲裂原活化蛋白激酶途經，啟動活化核因子NF-κB，進而激活RAGE基因啟動子，形成持續性的炎癥活化正反饋作用。

本研究以昆明種小鼠為動物實驗模型，以D-氨基半乳糖和脂多糖成功復制了陳恩強等[7]建立的動物急性肝功能衰竭模型。生化檢查示以D-氨基半乳糖和脂多糖處理小鼠后，在4～12 h內均出現ALT、AST、TBIL升高；4 h小鼠的肝臟組織學檢查已經出現肝細胞變性表現，8 h內出現細胞明顯壞死，而至24 h時肝臟組織學破壞程度達到峰值，出現大片壞死，僅有少量肝細胞殘存，本研究建立的動物模型合理地體現急性肝功能衰竭病理生理過程。

本研究實驗過程中，隨肝細胞損傷程度加重，免疫組化顯示RAGE蛋白主要由炎癥細胞表達，所以在實驗起始階段，肝臟組織內的表達量極低，在肝細胞損害后，肝組織炎細胞浸潤發生后，炎細胞內RAGE蛋白及mRNA水平逐漸升高，并伴隨了整個肝臟損害過程的進展。在組織學表現上，RAGE蛋白表達水平變化幾乎可以有效地代表肝組織內炎細胞的數量變化，提示RAGE在急性肝功能衰竭模型肝損害過程中有重要的意義。同時免疫組化檢測肝組織內NF-kBp65蛋白水平顯示肝衰竭4 h時主要表達于肝細胞核，8 h之后多見于肝細胞壞死區染色，此時，NF-κB在肝臟炎細胞及炎性細胞表達增強，12 h、24 h時肝細胞壞死區域及浸潤的炎癥細胞中表達增加。因此晚期糖基化終末產物受體及核轉錄因子在D-GalN+LPS 誘導的小鼠急性肝功能衰竭過程中起著重要作用，這為臨床上尋治療肝衰竭提供了理論基礎及新的思路。