腺樣體肥大伴分泌性中耳炎患兒的免疫功能分析

董 萍，姜立波

(1.舟山市婦幼保健院耳鼻喉科，浙江 舟山 316100；2.舟山市定海區中心醫院耳鼻喉科，浙江 舟山 316000)

分泌性中耳炎(secretory otitis media，SOM)是兒童常見多發病，以鼓室積液及聽力下降為主要臨床特征，常并發于腺樣體肥大。因早期癥狀不明顯、幼兒不善表達等因素，常發生延誤就醫、漏診情況，致患兒錯過最佳治療時期，可能導致患兒出現聽力不可逆下降或致聾，影響患兒的言語及智力發育，嚴重危害患兒的生命健康[1-2]。分泌性中耳炎的發病機制尚未明確，有研究發現，免疫因素可能與其發病相關[3]。腺樣體屬于鼻咽部淋巴組織的重要組成部分之一，其內含有大量不同發育階段的淋巴細胞和炎癥細胞因子，具有較強的免疫調節功能[4-5]。本研究通過比較腺樣體肥大伴SOM患兒及單純腺樣體肥大患兒腺樣體組織中的T淋巴細胞及炎癥細胞因子的表達情況，探討腺樣體分泌的T淋巴細胞及炎癥細胞因子與SOM發病的相關性，具體報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2015年3月至2018年2月期間舟山市婦幼保健院和舟山市定海區中心醫院收治的單純腺樣體肥大患兒65例作為對照組，腺樣體肥大伴SOM患兒70例作為觀察組，所有研究對象的監護人均知情同意參與本研究。所有患兒均經鼻咽部X線側位片、CT檢查或纖維鼻咽內鏡檢查等證實為腺樣體肥大，并行腺樣體切除術取腺樣體組織標本留樣，腺樣體肥大診斷標準參照增殖腺/鼻咽腔比率(A/N比率)測定方法，以A/N比率≥0.7顯示為病理性肥大[6]，SOM以鼓室聲導抗圖為B型、C型或As型，CT檢查鼓室積液陽性為診斷標準[7]。其中，對照組患兒男34例，女31例；年齡2～13歲，平均(7.9±2.4)歲；病程2～36月，平均(26.4±9.5)個月。觀察組患兒男37例，女33例；年齡3～14歲，平均(8.4±3.1)歲；病程3～32月，平均(28.2±10.0)個月。入組患兒均排除腺樣體機械性阻塞、鼻炎及支氣管哮喘、急性呼吸道感染、自身免疫性疾病及糖皮質激素用藥史等因素，臨床均表現為睡眠打鼾、睡眠不安、張口呼吸、聽力減退及耳鳴等。兩組患兒的性別、年齡、病程等一般資料比較，差異無統計學意義(均P>0.05)，具有可比性。

1.2免疫組化法檢測

采用免疫組化法分別檢測兩組患兒腺樣體組織中CD3+、CD4+、CD8+T細胞的陽性表達量及CD4+T/CD8+T值。鼠抗人CD3、CD4、CD8單克隆抗體，SP試劑盒，DAB顯色液均購自于北京中杉金橋生物技術有限公司。取留樣組織標本置10%福爾馬林溶液固定，常規石蠟包埋。免疫組化采用SP法，石蠟標本行5μm厚連續切片，常規脫蠟、梯度酒精水化；以3%H2O2室溫孵育10～20min去除內源性過氧化物酶活性；以0.01mol/L的構椽酸鹽緩沖液(pH=6)微波3檔加熱5min，行抗原修復；室溫冷卻后，以0.01mol/L PBS沖洗5min×3次；以5%BSA液37℃恒溫封閉30min；加入1:80稀釋的一抗，4℃孵育過夜。次日以PBS沖洗5min×3次，加入1:100稀釋的山羊抗兔IgG二抗工作液，37℃恒溫孵育20min，再以PBS沖洗5min×3次，加入1:100稀釋的辣根酶標記鏈酶卵白素工作液，37℃恒溫孵育20min，PBS沖洗5min×3次；DAB顯色，蘇木素復染，常規梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。以PBS溶液代替一抗作為陰性對照，以已知陽性高表達組織切片作為陽性對照。

CD3+、CD4+、CD8+T細胞均以胞膜或胞漿出現棕黃色顆粒為陽性，先在低倍視野(×100倍)下觀察免疫組化切片，選取細胞均勻分布視野，再隨機選取5個具有代表意義的高倍視野(×400倍)，以Image-pro plus6.0彩色圖像分析系統進行分析，分別計數視野中的陽性細胞數，以平均陽性細胞數占總細胞數的百分率反映CD3+、CD4+、CD8+T細胞的陽性表達量。

1.3 ELISA法檢測

采用ELISA法分別檢測兩組患兒腺樣體組織中TNF-α、IL-2、IL-6的含量。人TNF-α、IL-2、IL-6的ELISA試劑盒均購于上海紀寧實業有限公司，應用雙抗體夾心法進行檢測，檢測方法參照試劑盒說明書。

1.4統計學方法

2結果

2.1兩組T淋巴細胞陽性表達量的比較

CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞在觀察組和對照組患兒的腺樣體組織中均有大量表達，表達多集中于細胞膜或包漿中，顯色為棕黃色。與對照組患兒相比，觀察組患兒腺樣體組織中的CD3+、CD4+、CD8+T細胞的陽性表達量及CD4+T/CD8+T值均顯著升高，兩組間比較差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組T淋巴細胞陽性表達量的比較

2.2兩組TNF-α、IL-2、IL-6含量的比較

與對照組患兒相比，觀察組患兒腺樣體組織中TNF-α、IL-2、IL-6的含量均顯著升高，兩組間比較差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

組別 例數(n)TNF-α(ng/L)IL-2(ng/L)IL-6(ng/L)對照組65108.62±11.23172.21±20.35126.34±13.95觀察組70146.53±18.54215.54±22.48167.86±24.74t7.2818.0357.148P<0.05<0.05<0.05

3討論

3.1兒童SOM伴發腺樣體肥大的原因分析

分泌性中耳炎好發于兒童，研究發現，反復上呼吸道感染、扁桃體發炎、鼻竇發炎、咽鼓管功能障礙及免疫功能失調均可能引起分泌性中耳炎的發作[8-9]。由于兒童SOM發作常伴發腺樣體肥大，我們分析，其一，可能是因為肥大的腺樣體可直接壓迫咽鼓管咽口，使咽鼓管出現通氣功能障礙，減少耳內空氣流通，形成負壓，從而導致鼓室內出現積液[10]；其二，腺樣體內含有大量的淋巴細胞和炎癥細胞因子，腺樣體肥大易導致腺樣體局部出現免疫功能失調，進而誘發分泌性中耳炎[1]。

3.2 T淋巴細胞與SOM伴發腺樣體肥大的相關性

淋巴細胞是反應細胞免疫的重要細胞群，可通過檢測其中T淋巴細胞亞群的水平變化對機體的免疫功能進行監測[11]，其中，CD3+和CD4+分別代表T淋巴細胞和輔助性T淋巴細胞，二者協同調節免疫應答，具有增強機體免疫應答的作用，CD8+則代表抑制性T淋巴細胞，具有抑制機體免疫應答和T細胞增殖的作用，CD4+與CD8+相互拮抗，共同維持免疫功能的動態平衡[11]。眾多學者一致認為，CD4+T/CD8+T可作為衡量患者免疫功能狀態的一個重要指標，CD4+T/CD8+T值升高，顯示機體免疫功能增強，CD4+T/CD8+T值下降，則顯示機體免疫功能下降[12]。盡管腺樣體的免疫功能近年來愈發受到重視，但腺樣體中的免疫活性物質與SOM發病的相關性，仍有待進一步驗證。本研究比較了腺樣體肥大伴SOM患兒及單純腺樣體肥大患兒腺樣體組織中的CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞的表達情況和CD4+T/CD8+T值，結果顯示，腺樣體肥大伴SOM患兒腺樣體組織中CD3+、CD4+、CD8+T細胞的陽性表達量、CD4+T/CD8+T值均顯著高于單純腺樣體肥大患兒(P<0.05)，可見，上述T淋巴細胞亞群均可能參與了分泌性中耳炎的發生、發展過程，該結果與Kotowski等[13]和馬桂琴等[4]的報道基本一致。

3.3炎癥細胞因子與SOM伴發腺樣體肥大的相關性

腺樣體組織肥大能夠導致氣道堵塞，誘發機體組織細胞缺氧，進而刺激釋放大量TNF-α、IL-2、IL-6等多種炎癥細胞因子，其水平的異常變化可影響機體的免疫和防御功能，介導機體發生變態反應，導致滲出性中耳炎(OME)患兒病情反復，經久不愈[14-15]，其中，IL-6具有促進B淋巴細胞生長、分泌免疫球蛋白作用，能參與早期OME防御反應[16]。本研究比較了腺樣體肥大伴SOM患兒及單純腺樣體肥大患兒腺樣體組織中TNF-α、IL-2、IL-6炎癥細胞因子的表達情況，結果顯示，腺樣體肥大伴SOM患兒腺樣體組織中TNF-α、IL-2、IL-6的含量均顯著高于單純腺樣體肥大患兒(P<0.05)，可見，上述炎癥細胞因子的大量釋放也可能是分泌性中耳炎反復發作的機制之一，該結果與白治田等[17]和劉衛衛等[18]的報道基本一致。

終上所述，腺樣體肥大伴SOM患兒腺樣體局部T淋巴細胞及炎癥細胞因子的表達均顯著上升，可能誘導腺樣體局部免疫功能失調，進而誘發SOM反復發作。