胃泌素和膽囊收縮素及其受體氨基酸序列信息學比較分析

楊 陽，侯 宇，趙樹林，李璐璐，孫小燕，阿迪萊·艾力，趙紅瓊

(新疆農業大學動物醫學學院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】胃泌素-膽囊收縮素家族多肽包括胃泌素(Gastrin, GAS)、膽囊收縮素(Cholecystokinin，CCK)、雨蛙素(Cerulein)和原脊索動物(Proctochordea)神經肽(Cionin)等多肽[1]，在哺乳動物胃泌素-膽囊收縮素家族僅有GAS和CCK。GAS主要分泌于胃和十二指腸粘膜G細胞，而CCK主要分泌于十二指腸和空腸黏膜I細胞，它們對于消化液的分泌、消化道的生長發育具有重要的調節作用。在進行多肽功能研究、特異性抗體制備等過程中要注意動物氨基酸序列不同與受體的親和力可能不同；多肽抗原序列不同，產生的抗體特異性不同，有必要了解目的多肽及其受體在動物種屬之間的差異以及進化關系。【前人研究進展】根據氨基酸序列的長短，GAS主要包括具有34和17個氨基酸的GAS-34和GAS-17，CCK主要包括具有58、33和8個氨基酸的CCK-58、CCK-33和CCK-8。根據GAS和CCK羧基端(C-端)分別對應的第6位和第7位酪氨酸(Tyr)是否發生硫酸化，分為非硫酸化(-I)和硫酸化(-II)GAS和CCK，例如含17個氨基酸序列的非硫酸化胃泌素可表示為GAS-17-I，含33個氨基酸序列的硫酸化膽囊收縮素可表示為CCK-33-II。GAS-CCK家族包括CCK-A受體和CCK-B受體，均為7次跨膜(7-Transmembrane，7-TM)受體。7-TM受體一般包括N-端胞外域(含糖基化位點)、跨膜域(含三個細胞外環，三個細胞質環和七個疏水的跨膜片段)和C-端胞漿域(含蛋白激酶硫酸化位點)[3-4]。CCK-A僅同CCK-II結合力強[5]，而CCK-B無論GAS和CCK酪氨酸硫酸化的程度如何均可結合，因而CCK-B也稱為GAS/CCK-B受體[6-8]。【本研究切入點】目前，針對不同動物GAS和CCK及其受體氨基酸序列信息學的比較分析研究較少。研究對胃泌素和膽囊收縮素及其受體的氨基酸序列信息學進行比較分析。【擬解決的關鍵問題】研究比較GAS和CCK兩種激素及其受體的氨基酸序列在不同動物種間的差異性，特別是羊同其他動物之間的序列差異，并進行生物信息學分析，為GAS-CCK家族多肽或受體對羊生長調控等領域的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

通過UniProt數據庫 (https://www.uniprot.org/)用“Gastrin”或“CCK”為關鍵詞檢索Gastrin和CCK及其受體的氨基酸序列，在同一種動物有多個數據信息的時候，主要選用Swiss-Prot 標記“引用(Reviewed)”的數據。再用“排列(Align)”功能進行綿羊(Sheep)的某一種GAS和CCK多肽或受體蛋白氨基酸序列(主要為成熟肽或蛋白區域，不包括信號肽和原肽等)與其他動物序列差異進行比較。同時，比對了綿羊CCK-A與CCK-B氨基酸序列，并標明各自7次跨膜區域，為其抗原設計提供膜內外區域參考。

1.2 方 法

用1.1篩選出的不同動物GAS和CCK全肽或受體蛋白氨基酸，包括信號肽(Signal peptide)、原肽(Propeptide)、成熟肽(Peptide)等所有氨基酸序列，通過DNAstar的Megalign 7.1構建GAS和CCK全肽或受體蛋白氨基酸序列進化樹[9]。

2 結果與分析

2.1 不同動物GAS氨基酸序列比對

研究表明,綿羊(Sheep，UniProt 登錄號O02 686，下同)GAS-34氨基酸序列同山羊(Goat，P04 564)、牛(Bovine，P01 352)、人(Human，P01 350)、小鼠(Mouse，P48 757)、大鼠(Rat，P04 563)、豬(Pig，P01 351)、豚鼠(Guinea pig，P06 885)、兔(Rabbit，G1TS39)、馬(Horse，P55 885)、狗(Dog，P01 353)、貓(Cat，P01 354)、駱駝(Camel，S9XCX3)、雞(Chicken，Q9PU41)、魚(Fish，A0A0M4JAV4)等14種動物比對情況。從比對結果可知，除了雞和魚，其他動物GAS-34的C-端7個氨基酸完全相同；綿羊、山羊和牛GAS-34氨基酸序列完全相同；雞和魚GAS僅C-端4個氨基酸序列同其它動物。圖1

注：藍色背景氨基酸表示與綿羊GAS氨基酸序列比對不同的氨基酸

Note: The amino acids with blue background show differences compared to sheep gastrin

圖1 不同動物GAS氨基酸序列比較
Fig.1 Comparison of gastrin amino acid sequences in different animals

在UniProt中用BLAST比較可知，綿羊的GAS氨基酸全長序列同山羊比較完全相同，相似性為100%；其次為牛，相似性為95.2%；同人、大鼠和小鼠相似性分別為69.7%、67.7%和67%。未在BLAST所列的250個氨基酸序列數據庫中找到雞和魚的氨基酸比對數據。

用Megalign構建進化樹分析GAS全氨基酸序列表明，羊與牛，狗與貓，兔與駱駝，大鼠與小鼠，魚與雞分別在同一個分支上，草食動物相對較近，而非草食動物相對草食動物遠；魚和雞與其他哺乳動物相距最遠。圖2

圖2 不同動物GAS全氨基酸序列進化樹
Fig. 2 Evolution tree of whole gastrin amino acid sequence in different animals

2.2 不同動物CCK氨基酸序列比對

研究表明,綿羊(Sheep，W5NZD6)CCK-33氨基酸序列同牛(Bovine，P41 520)、貓(Cat，M3W5D6)、小鼠(Mouse，P09 240)、豬(Pig，P01 356)、兔(Rabbit，G1T9Y3)、狗(Dog，Q9TS44)、人(Human，P06 307)、大鼠(Rat，P01 355)、馬(Horse，F7BAG1)、駱駝(Camel，S9WZ08)、鴕鳥(Ostrich，Q9PU29)、雞(Chicken，Q9PU41)、金魚(Goldfish，O93 464)、豚鼠(Guinea pig，H0VR95)等14種動物比對情況。所有比對的15種動物CCK-4(C-端4個氨基酸)完全相同；綿羊、牛和貓CCK-33序列完全相同；除了豚鼠外，所有比對動物CCK-8(C-端8個氨基酸，為具有生物活性的最小CCK)完全相同；鴕鳥、雞、金魚和豚鼠CCK-33氨基端與綿羊等比較差異較大。

用Megalign構建進化樹分析CCK氨基酸全序列表明，綿羊與牛，豬與貓，大鼠與小鼠，人與兔，鴕鳥與雞分別在同一個分支上；魚類和禽類與其他哺乳動物相距較遠。在UniProt中用BLAST比較可知，綿羊同牛CCK氨基酸序列全長的相似性最高，達95.7%；其次為狗，達91.4%；同人、大鼠和小鼠相似性分別為80%、76.8%和74.8%；與鴕鳥的相似性最低，僅為49.2%。未在BLAST所列的250個氨基酸序列中檢索到與豚鼠的相似性數據。

注：藍色背景氨基酸表示與綿羊CCK氨基酸序列比對不同的氨基酸

Note: The amino acids with blue background show differences compared to sheep CCK

圖3 不同動物CCK氨基酸序列比較
Fig. 3 Comparison of CCK amino acid sequence in different animals

圖4 不同動物CCK全氨基酸序列進化樹
Fig. 4 Evolution tree of whole CCK amino acid sequence in different animals

2.3 不同動物CCK-A和CCK-B氨基酸序列比較

研究表明,CCK-A氨基酸序列進化樹包括羊(Sheep，W5PET0)、牛(Bovine，A6QLH2)、人(Human，P32 238)、大鼠(Rat，P30 551)、小鼠(Mouse，O08 786)、豬(Pig，I3LFK5)、豚鼠(Guinea pig，Q63 931)、兔(Rabbit，O97772)、馬(Horse，F7AHW8)、狗(Dog，Q5D0K2)、貓(Cat，M3W880)、雞(Chicken，E5RVJ7)和魚(Fish，H2LRS6)。在進化樹中，大鼠與小鼠、狗與貓、羊與牛分別在同一個分支上，魚類和禽類同其他哺乳動物相距較遠。BLAST分析顯示相對于綿羊CCK-A的氨基酸序列，與之相似性最高的是牛，為92.2%；其次為人、貓、豬，分別為87.6%、87.4%、87.2%；魚與綿羊CCK-A相似性最低，僅為59.4%。圖5

研究表明，CCK-B氨基酸序列進化樹，包括羊(Sheep，W5QBM9)、牛(Bovine，P79266)、人(Human，P32239)、大鼠(Rat，P30553)、小鼠(Mouse，P56481)、豬(Pig，A0A287A2K5)、豚鼠(Guinea pig，H0VZC5)、兔(Rabbit，P46627)、馬(Horse，F6S229)、狗(Dog，P30552)、貓(Cat，M3WFK8)，雞(Chicken，A0A1D5P3F3)和金魚(Goldish，A0A0D5CPE1)。在進化樹中，羊與牛、狗與貓、兔與人、豚鼠、大鼠與小鼠分別在同一個分支上，魚類和禽類與其他哺乳動物相距較遠。BLAST分析顯示，對于綿羊CCK-B的氨基酸序列，相似性最高的為牛，達98.7%，其次為豬，達94.7% ，與雞相似性最低，僅為57%。圖6

圖5 不同動物CCK-A全氨基酸序列進化樹
Fig. 5 Evolution tree of whole CCK-A amino acid sequences in different animals

圖6 不同動物CCK-B全氨基酸序列進化樹
Fig. 6 Evolution tree of whole CCK-B amino acid sequences in different animals

從UniProt數據庫檢索發現綿羊CCK-A(W5PET0)和CCK-B(W5QBM9)氨基酸序列長度分別為452個和454個，位點相同氨基酸有216個，相似性為45.094%，但兩個受體氨基酸序列均為“Unreviewed”。兩個受體氨基酸序列比較可知，CCK-A和CCK-B的N-端胞外域分別為1～59和1～57位，C-端胞漿域分別為397～452和400～454位；兩種受體七個疏水的跨膜片段氨基酸位置比較相近，但序列有所差異。圖7

注：藍色背景部分氨基酸為7次跨膜區域

Note：Amino acid with blue background means the 7-TM region

圖7 綿羊CCK-A和CCK-B氨基酸序列比較
Fig.7 Amino acid sequences of the sheep CCK-A and CCK-B

3 討 論

對不同動物GAS和CCK及其受體氨基酸序列進行了比較，該比較結果可為不同動物這兩種多肽及其受體蛋白抗原設計和活性多肽篩選提供參考。無論GAS還是CCK其生物學活性部位均在C-端[10]，序列比對結果顯示不同動物之間C-端氨基酸序列相對于N-端序列具有高度的保守性。盡管在生理功能方面GAS被認為主要是促進胃液的分泌，而CCK主要是促進膽囊收縮，但在生理功能方面兩者具有一定交叉性，例如刺激膽汁和ghrelin分泌等功能[11-13]。因此，在用ELISA、蛋白印跡和放射免疫等方法檢測和定位組織中GAS或CCK多肽的時候，要注意使用的抗體是否存在與CCK或GAS的交叉反應問題，如果存在交叉反應，多肽含量檢測結果將偏高，而其組織定位可能出現假陽性。

從受體親和力看，CCK-A僅同C-端第7位酪氨酸硫酸化的CCK(即CCK-II)結合力強，也就是說，如果要激活CCK-A受體，除了需要C-端保守的氨基酸序列外，第7位酪氨酸硫酸化也是必須的[14]。相反，無論GAS和CCK是否酪氨酸硫酸化，CCK-B均可與其結合[15]。目前，市面上出售的GAS或CCK產品，主要是根據人或鼠類氨基酸序列制備，因而在選購用于其他動物的GAS或CCK產品時，要關注購買多肽C-端序列是否和目的動物的相似，相似性越高，則在目的動物使用與其內源性受體親和力越高，受體激活后表現出的生物學效應也越強。Zhao等[16]研究表明，一次性靜脈注射牛GAS-17和GAS-34(無論是否第6位酪氨酸硫酸化)均可促進犢牛血液生長激素水平升高，而注射同樣摩爾劑量CCK-4或者GAS-9均未影響犢牛生長激素水平，可見雖然后兩種多肽與前兩種多肽C-端部分氨基酸相同，但是卻無該促進生長激素分泌的生物學效應。

CCK-A和CCK-B兩種受體亞型均屬于G蛋白偶聯7-TM受體家族，包括N-端胞外域(含糖基化位點)、跨膜域(含三個細胞外環，三個細胞質環和七個疏水的跨膜片段)和C-端胞漿域(含蛋白激酶硫酸化位點)[17-18]。研究顯示，羊CCK-A和CCK-B兩種受體相似性僅為45.094%，這可能是它們同內源性配體(GAS和CCK)親和力不同的原因之一[19]。在用多肽片段為抗原制備膜受體特異性抗體的時候，最好選擇靶動物N-端胞外域或跨膜域的三個細胞外環氨基酸序列，這樣利于將來獲得的抗體在不破壞細胞的情況下與靶動物受體膜外區域結合。同樣，在選擇商品化受體抗體的時候，也要關注其使用的抗原氨基酸序列是否在靶動物受體序列存在或相似度高，以此初步判定是否可使用該商品化受體抗體。

哺乳動物血液循環中具有生物活性最小的GAS是GAS-17[20-21]；研究顯示，雞和魚GAS的C-端僅有5個氨基酸與哺乳動物相同，因而在禽類和魚類是否存在具有生物活性的GAS值得探討。哺乳動物血液循環中具有生物活性最小的CCK是CCK-8，而雞和魚CCK的C-端有10個氨基酸與哺乳動物相同，因而從氨基酸序列比對結果可以推測在禽類和魚類應具有生物活性的CCK。

4 結 論

除了雞和魚，其他動物GAS-34的C-端7個氨基酸完全相同；綿羊、山羊和牛GAS-34氨基酸序列相似性為100%；雞和魚GAS僅C-端4個氨基酸序列同其它動物。所有比對的15種動物CCK-4(C-端4個氨基酸)完全相同；綿羊、牛和貓CCK-33序列相似性為100%；除了豚鼠外，所有比對動物CCK-8(C-端8個氨基酸，為具有生物活性的最小CCK)完全相同。

綿羊的GAS氨基酸全長序列同山羊比較完全相同，相似性為100%；其次為牛，相似性為95.2%；綿羊同牛CCK氨基酸序列全長的相似性最高，達95.7%；其次為狗，達91.4%。從GAS和CCK及受體全氨基酸序列(包括信號肽和原肽)來看，禽類和魚類序列同哺乳動物差距均較大；綿羊CCK-A與CCK-B氨基酸序列相似性僅為45.094%。

GAS和CCK的C-端氨基酸序列在不同動物之間均具有高度的保守性，而N-端為變化區域。該信息分析學結果為不同動物這兩種多肽及其受體蛋白抗原設計和活性多肽篩選等研究提供參考。