Hoxc13基因在蘇博美利奴羊胎羔生長發育期不同組織中的表達分析

杜建文，何軍敏，陳春艷，田月珍，徐新明，付雪峰，哈尼克孜·吐拉甫，

趙冰茹1，朱 樺1，黃錫霞1，田可川2

(1.新疆農業大學動物科學學院，烏魯木齊，830052；2.新疆畜牧科學院畜牧研究所，烏魯木齊，830011)

0 引 言

【研究意義】蘇博美利奴羊是超細毛美利奴羊新品種，在2014年5月通過了國家農業部的驗收，于我國新疆阿克蘇地區拜城縣種羊場培育出[1]。該品種具有抗逆性強、繁殖成活率高、羊毛細度為17～18 μm、羊毛品質好、產毛量高等特點[2]。羊毛受多種基因調控，其發育源于皮膚毛囊，是皮膚的衍生物[3]。美利奴細毛羊皮膚開始形成初級毛囊約在胚胎發育至50 d；形成初級毛囊約在70 d；第一種次級毛囊開始出現，約在胚胎發育至85 d；第二種次級毛囊開始形成，約在胚胎發育至105 d；至羔羊出生時，所有的毛囊都已形成[4-6]。【前人研究進展】研究已經發現了大量毛囊發育的相關基因參與了毛發周期性生長和毛發形態發生的發育。例如Hox基因、骨形成蛋白、Msx基因、成纖維生長因子、Wnt和Shh等基因，還有大量的激素也一起參與了毛囊生長發育的調控[7]。Hox基因是和腫瘤、胚胎發育以及其他各種疾病的發生密切相關的重要因子，與癌癥發展和細胞周期控制密切相關的突出例子是Hox11[8]。Hox基因目前已鑒定的共有39個在哺乳類動物中，是重要的轉錄調節因子，其對毛囊細胞的分化與增殖有著重要作用[9-11]。在胚胎發育時期，Hox基因與動物的發育相關的頭尾軸和背負軸的表達，受到對控基因與間隔基因的調控，模式表達為時空共線性[12]。Hox基因中Hoxc13是第一個被證實在控制毛發的發育和生長中有著重要作用的基因，當它過量表達或者缺少時，小鼠毛發生長都會表現出缺陷[13]。【本研究切入點】近年來對基因的表達量進行了研究，尋找相關的分子標記。研究蘇博美利奴羊不同組織中Hoxc13基因mRNA的表達量差異。【擬解決的關鍵問題】研究Hoxc13基因在蘇博美利奴羊不同組織和皮膚中的定量表達，建立蘇博美利奴羊皮膚、肌肉以及不同內臟組織中GAPDH基因的SYBR Green Ⅱ RT-PCR的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣本

試驗羊群體是來自新疆科創畜牧繁育中心的蘇博美利奴羊，對胎齡分別為65和135 d兩個時期公羔的左側肩胛部皮膚，右腿大腿后側肌肉以及不同內臟組織(心臟、脾臟、肝臟、肺臟、腎臟)進行采集，置于凍存管中，于-80℃冰箱保存，用于后續總RNA的提取。

1.1.2 主要儀器設備

研究所用的儀器設備主要有ZHJH-C1112B超凈工作臺、∑H2O摩爾超純水儀、BIOFUGE PRIMO R型低溫離心機、Thermo NanoDrop 2000微量分光光度計、BIO-RAD凝膠成像系統、BIO-RAD普通PCR儀、BIO-RAD實時熒光定量PCR儀、LDZM-80KCS-Ⅲ立式壓力蒸汽滅菌鍋、GZX-9140MBE電熱恒溫鼓風干燥箱、METTLER TOIEDO電子天平、DYY-6C型電泳儀、微型離心機、IKA MS3渦旋振蕩器、Eppendorf移液器等。

表 主要儀器設備
Table 1 Main equipment

主要儀器供應商 ZHJH-C1112B超凈工作臺海爾-20℃冰箱海爾4℃冰箱中科美菱超低溫冷凍儲存箱美的微波爐∑H2O摩爾超純水儀BIOFUGE PRIMO R型低溫離心機Thermo NanoDrop 2000微量分光光度計BIO-RAD凝膠成像系統BIO-RAD普通PCR儀BIO-RAD實時熒光定量PCR儀LDZM-80KCS-Ⅲ立式壓力蒸汽滅菌鍋GZX-9140MBE電熱恒溫鼓風干燥箱METTLER TOIEDO電子天平DYY-6C型電泳儀DYY-Ⅲ32型電泳槽微型離心機IKA MS3渦旋振蕩器雪科制冰儀Eppendorf移液器 上海智城分析儀器制造有限公司山東山東山東廣東上海摩勒科學儀器廠美國Thermo公司美國美國美國美國上海申安醫療器械廠上海博訊實業有限公司醫療設備廠德國北京六一北京六一杭州奧盛儀器德國江蘇德國eppendorf公司

1.1.3 主要試驗試劑

SYBR Green Ⅱ 熒光染料試劑盒、cDNA合成試劑盒(TaKaRa)、Trizol試劑、MarkerDL2000、Taq酶等，購自上海生工生物公司；硼酸、瓊脂糖、核酸染料、無水乙醇、Tris堿、DEPC、氯仿、四甲基乙二胺(EDTA)、異丙醇等均由北京鼎國生物有限公司提供。

1.1.4 溶液配置

試劑的配置需要調節pH值的試劑在調節pH值后，需要進行高壓滅菌處理，其滅菌條件為：1.034×105Pa，蒸汽滅菌20 min；在無特殊要求的情況下溶劑均為超純水。以黃培堂[14]的分子克隆實驗指南精編版為試驗中試劑配制的參考。

(1)75%乙醇溶液：將75 mL無水乙醇加入25 mL超純水中，使其充分混勻；

(2)0.5 moL/L EDTA：18.61 g EDTA- Na 2H2O，80 mL水，將pH值調至8.0并定容至100 mL，高壓滅菌后4℃過夜；

(3)5×TBE：分別加入27 g Tris堿、0.5 M EDTA(pH 8.0)10 mL、13.75 g硼酸于容量瓶中，定容至500 mL；

(4)0.5×TBE：取10 mL 5×TBE溶于90 mL超純水中，充分混勻；

(5)1%瓊脂糖：向100 mL 0.5×TBE中加入1 g瓊脂糖，在微波爐中加熱使其充分溶解；

(6)2%瓊脂糖：向100 mL 0.5×TBE中加入2 g瓊脂糖，在微波爐中加熱使其充分溶解；

(7)0.01%DEPC水：取1 mL DEPC溶于1 000 mL超純水中，將其充分混勻后高壓滅菌，37℃孵化過夜。

1.2 方 法

1.2.1 目的基因引物設計

采用引物設計軟件Primer Premier 5.0根據NCBI提供的基因序列進行引物設計，并送至上海生工生物工程有限公司合成所需引物。引物設計的基本原則為避免引物二聚體以及具有特異性，上下游引物不能相差太大，引物長度在17～25個堿基以內，G C含量在40%～60%，避免DNA污染，堿基隨機分布等。列出試驗引物序列。表2

表2 實時熒光定量PCR引物序列
Table 2 Real-time PCR primer sequences

基因Gene引物序列(5'→3')Primer sequence(5'→3')產物長度(bp)Product length(bp)退火溫度(℃)Annealing temperature(℃)GAPDHF:GAGATCAAGAAGGTGGTGAAGCAGR:GTAGAAGAGTGAGTGTCGCTGTTG11358Hoxc13F: GCTGCCGCCTGTCTCACAACR: ACCGACACGTCCAGGTAGCC18762.8

注：F：代表上游引物 R：代表下游引物

1.2.2 蘇博美利奴羊不同組織RNA的提取及檢測

(1)取細毛羊的皮膚及六種不同組織50～100 mg樣品置于研缽中，分別在液氮中快速研磨成碎末狀；

(2)分別在2 mL離心管中添加1 mL Trizol試劑，再用在液氮中預冷的小勺將研缽中的組織碎末刮出，并將其加入離心管中渦旋混勻，室溫放置5 min；

(3)將離心管放入低溫離心機中12 000 r/min，4℃，離心10 min，取新的2 mL離心管向其中加入200 μL氯仿，將離心后的上清液取出移入離心管中，劇烈搖動15 s后室溫放置3 min；

(4)低溫離心機中12 000 r/min，4℃，離心15 min，另取一新的1.5 mL離心管，將溶有RNA的上層上清液(約500 μL)轉移至其中；

(5)添加500 μL(等體積)異丙醇于裝有取出的上清液的離心管中，漩渦混勻，室溫放置30 min；

(6)低溫離心機中12 000 r/min，4℃，離心10 min，棄上清，在剩下的沉淀物中加入1 mL 75%的乙醇洗滌；

(7)低溫離心機中8 000 r/min，4℃，離心5 min，去乙醇，將殘留的少量液體瞬時離心后用移液槍小心吸出，室溫放置5 min；

(8)添加適量DEPC水(30～50 μL)，根據提取出的RNA沉淀量的多少選擇，渦旋混勻，使其充分溶解RNA；

(9)分裝出3 μL提取出的RNA溶液，用于RNA的純度檢測，剩余提取出的RNA溶液于-80℃冰箱中保存；

(10)純度檢測：先用ddH2O將微量分光光度計調零，再取2 μL RNA提取物測定其純度，檢測要求OD260/OD280的數值在1.8～2.0。

1.2.3 反轉錄合成cDNA

(1)將樣本RNA于冰盒上解凍，反轉錄試劑盒于室溫解凍；

(2)用微量分光光度計檢測樣本RNA濃度，記錄并計算所需RNA以及RNase-free ddH2O的使用量；

(3)按表3成分于冰盒上配置反應步驟一體系混合液1，然后分裝到每個PCR管中，最后加入RNA樣品；表3

(4)將裝有配置好的混合液1的PCR管放入普通PCR儀中42℃ 2 min；

(5)按表4成分于冰盒上配置反應步驟二體系混合液2；

(6)取出PCR管，分別向裝有混合液1的PCR管中分裝10 μL混合液2；

表3 反應步驟一體系
Table 3 Reaction Step 1: System

試劑Reagent使用量Usage amountgDNA Eraser5X gDNA Eraser BufferRNase-free ddH2ORNA模板1 μL2 μL補至10 μL1 μL

(7)輕柔混勻，放入PCR儀中37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃保存，反應結束后取出反應管置于-20℃冰箱儲存。表4

表4 反應步驟二體系
Table 4 Reaction Step II: System

試劑Reagent使用量Usage amountPrimeScript RT Enzyme MixⅠ5X PrimeScript Buffer 2 (for Real Time)RT Primer MixRNase-free ddH2O1 μL4 μL1 μL4 μL

1.2.4 熒光定量PCR反應體系的建立

所有提取出的樣品RNA都用內參引物GAPDH擴增，再分別用相對應的Hoxc13基因引物做3個平行樣本進行擴增，并與內參引物擴增的片段長度進行對比。具體的試驗操作流程按照產品的說明書實施。

(1)配置Real Time反應體系。表5

表5 PCR反應體系
Table 5 PCR reaction system

組成成分Composition體積VolumecDNA模板SYBR上游引物下游引物RNase-free ddH2O1 μL12.5 μL0.5 μL0.5 μL10.5 μL

(2)在Bio-Rad公司的CFX96實時熒光定量PCR儀上建立反應程序。表6

(3)熒光定量PCR產物檢測：取5 μL的熒光定量PCR產物與1 μL的6×Loading buffer充分混勻，在110 V條件下2%瓊脂糖凝膠電泳20 min進行檢測，產物片段的大小以DL2000為Marker來標記。

表6 熒光定量PCR反應程序
Table 6 Fluorescence quantitative PCR reaction procedure

反應程序Reaction procedure溫度Temperature時間Time預變性變性退火延伸(收集熒光)95℃95℃62.8℃95℃30 s5 s30 s5 s 循環40次

1.3 數據處理

使用軟件SPSS19.0進行組間差異顯著性分析，使用Excel軟件對內參基因及目的基因的相對表達水平進行統計分析，每個分析對象都采用3次重復試驗數據的平均值。

相對定量分析2-△△Ct公式：

ΔCt= 目的基因平均Ct-內參基因平均Ct

(1)

ΔΔCt=ΔCt(待測樣本)-ΔCt(對照樣本)

(2)

F= 2-△△Ct

(3)

Ct值：每個反應熒光信號達到設定閾值所經歷的循環數。

圖1Hoxc13基因經瓊脂糖凝膠電泳檢測
Fig.1Hoxc13 gene detected by agarose gel electrophoresis

2 結果與分析

2.1 實時熒光定量PCR

2.1.1 實時熒光定量PCR擴增產物的檢測

用美國Thermo公司的NanoDrop 2000微量分光光度計對從蘇博美利奴羊各組織器官中提取出的RNA進行純度檢測，經檢測OD260/OD280讀數在1.8～2.0，說明所提取出的RNA純度高，可以用作后續的試驗；使用2%的瓊脂糖進行凝膠電泳檢測，結果表明，Hoxc13基因經瓊脂糖電泳檢測，結果顯示與預期的擴增片段大小一致，無非特異性條帶，可用于后續的試驗。圖1

2.1.2 熔解曲線

將試驗反應體系中目的基因Hoxc13和內參基因GAPDH的擴增曲線和熔解曲線進行分析，研究表明，擴增前期曲線重合性好并且為單一峰，曲線為S型熒光定量動力學曲線，為理想型擴增曲線。熔解曲線分析結果表明，GAPDH和Hoxc13基因的熔解溫度分別近似為84和81℃；各基因熔解曲線均只有一個特異峰，未出現引物二聚體，說明GAPDH基因及Hoxc13基因的特異性好，PCR反應條件得到了較好的優化。圖2，圖3

圖2 不同組織GAPDH基因熒光定量PCR擴增及熔解曲線
Fig.2 Fluorescence quantitative PCR amplification and melting curve ofGAPDHgene in different tissues

圖3 不同組織Hoxc13基因熒光定量PCR擴增及熔解曲線
Fig.3 Fluorescence quantitative PCR amplification and melting curve of different tissues ofHoxc13 gene

2.2 不同組織不同時期中Hoxc13基因的表達量

在定量檢測試驗中，內參基因是GAPDH，運用SYBR Green Ⅱ染料實時熒光定量PCR的方法來進行驗證。試驗采用相對定量法，以GAPDH基因作為內參基因，對蘇博美利奴羊胎齡在65和135 d兩個時期，各三只羊的皮膚和六種不同組織(肌肉、心臟、脾臟、肝臟、肺臟、腎臟)中，Hoxc13基因mRNA的表達量進行了分析。圖4

圖4Hoxc13基因在65 d不同組織中的表達量
Fig.4 Expression of Hoxc13 gene in different tissues at 65 days

2.2.1Hoxc13基因65 d各組織中的表達量

研究表明，選擇ΔCt值最小的組織(肝臟)為參照。蘇博美利奴羊在胎齡65 d時Hoxc13基因的相對表達量在各組織器官中差異極顯著，在肝臟中的表達量極顯著高于在其它各組織和皮膚中的表達量(P< 0.01)，在皮膚、心臟、腎臟和脾臟中的表達量顯著高于在肺臟和肌肉組織中的表達量(P< 0.05)。

2.2.2Hoxc13基因135 d各組織中的表達量

研究表明，蘇博美利奴羊在胎齡135 d時Hoxc13基因在皮膚和各組織中的相對表達量有顯著差異，在皮膚中的表達量顯著高于在肌肉、心臟、脾臟、肝臟、肺臟、腎臟組織中的表達量(P< 0.05)。Hoxc13基因在135 d胎齡的蘇博美利奴羊的各組織器官中均有表達，并且在皮膚中最高。圖5

圖5Hoxc13基因在135 d不同組織中的表達量
Fig.5 Expression ofHoxc13 gene in different tissues at 135 days

2.2.3 不同時期中Hoxc13基因的表達量分析

在胎齡65和135 d這兩個時期，以65 d這一時期作為參照，分析135 d皮膚和各組織中Hoxc13基因的相對表達量，胎齡在135 d時期較65 d這一期，Hoxc13基因在皮膚中的表達量顯著高于在肌肉、心臟、脾臟、肝臟、肺臟、腎臟組織中的表達量(P< 0.05)，Hoxc13基因與毛囊發育密切相關。圖6

圖6Hoxc13基因在不同時期不同組織中的表達量
Fig.6 Expression ofHoxc13 gene in different tissues at different times

3 討 論

3.1 RT-PCR分析

RT-PCR技術是一種對不同樣品間，基因的差異表達水平進行比較及測定的權威性方法，哈尼克孜·吐拉甫等[15]做了分子遺傳標記在綿羊育種中的研究；田月珍等[16]對中國美利奴羊(新疆型)皮膚組織建立了GAPDH基因RT-PCR方法。內參基因選用GAPDH基因，不但對細微表達差異的生物學研究具有重要意義，還有助于校正系統誤差，得到更為準確可靠的結果[17]。試驗的RT-PCR結果表明，實時熒光定量PCR法可用于蘇博美利奴羊不同組織器官中Hoxc13基因表達差異的測定。

3.2 Hoxc13基因在不同組織中的表達

柳楠等[18]在Hox基因家族對細毛羊羊毛性狀影響的研究中表明，Hoxc13基因與毛囊的生長發育與分布有關，其mRNA表達強度與羊毛長度存在顯著的正相關，并影響羊毛物理性狀。試驗的實時熒光定量PCR結果顯示Hoxc13基因在蘇博美利奴羊的皮膚和不同組織(肌肉、心臟、脾臟、肝臟、肺臟、腎臟)中均有表達，且存在差異性。在胎齡65 d時期，Hoxc13基因的相對表達量在各組織器官中差異極顯著，在肝臟中的相對表達量最高，其次是心臟、腎臟、皮膚和脾臟組織，在肺臟和肌肉組織中相對表達量最低。在胎齡135 d時期，Hoxc13基因在各組織器官中均有表達，其相對表達量在皮膚中顯著高于在肌肉及各內臟組織中的表達量，在各組織間的相對表達量無顯著差異。

3.3 Hoxc13基因在不同時期中的表達

對比胎齡在65和135 d兩個時期Hoxc13基因在不同組織中的相對表達量，實時熒光定量PCR結果顯示，在蘇博美利奴羊不同組織和皮膚中均有Hoxc13基因的表達。毛囊的發育始于胚胎期皮膚，阿布來提·蘇來曼等[19]對蘇博美利奴羊胎兒皮膚毛囊結構及形態發育做了相關研究，研究結果表明，蘇博美利奴羊胚胎形成初級毛囊的重要時期是胎齡65～75 d；次級毛囊形成期是胎齡80～85 d；次級毛囊的大量再分化是胎齡105～135 d。試驗結果表明,Hoxc13基因廣泛表達于蘇博美利奴羊各組織器官中，并且其相對表達量在蘇博美利奴羊皮膚中最高，推測該基因在皮膚中的表達有重要意義，這與Hoxc13基因的表達水平對毛發生長和毛囊發育影響顯著的研究相符[20]。

4 結 論

Hoxc13基因在蘇博美利奴羊各組織器官中均有表達且存在表達差異；并且在皮膚中Hoxc13基因的表達量高于在肌肉、腎臟、心臟、脾臟、肺臟和肝臟組織，Hoxc13基因可能與毛囊發育的過程密切相關。