基于PCR檢測的4種土傳病害病原菌侵染棉花的動態分析

許泰百，薩吉達木·艾則孜，吳 瓊，李玉華，李 進，郭慶元

( 1.新疆農業大學農學院，烏魯木齊 830052；2.新疆農業科學院核技術生物技術研究所，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】2017年，新疆棉花播種面積達到2 217.47×103，占全疆農作物總播種面積的36.58%，產量達到456.60×104t[1]。長年連作導致棉花多種病害嚴重發生，新疆棉區也成為全國棉花土傳病害發生最嚴重的區域之一[2]。新疆棉花病害主要包括立枯病、紅腐病、枯萎病和黃萎病四種土傳病害,以及部分地區零星發生的細菌性角斑病以及炭疽病兩種莖葉部侵染病害。其中以四種土傳侵染病害危害較重，常造成爛種、爛芽、爛根和莖基部腐爛，進而導致死苗，造成缺苗斷壟，降低單產。近年來，立枯病發生普遍，紅腐病開始日趨嚴重，黃萎病已經成為棉花生產中最重要的病害，枯萎病發生普遍，但因品種抗性使其嚴重度得到一定控制[3]。了解這幾種病害的發生和流行動態，建立高效實用的防控技術及防控體系，提高對于這幾種病害的防控水平具有重要意義。【前人研究進展】針對上述四種棉花病害及其病原菌早有研究，也有許多報道，但多集中在棉花某一種病害的病原、特點、發病條件、檢測手段及防治方法方面的研究；也偶有對兩種病害田間發生動態的調查。荊寶健[3]研究控制新疆棉花苗期病害的有效途徑，王芙蓉等[4]分析了棉花根際真菌群落結構及其動態變化，李國英[5]描述了枯萎病和黃萎病田間發生流行和人工接種發病的時間動態。姜玉英等[6]總結了1991至2017年新疆病蟲害演變動態，指出新疆發生為害加重、苗期病害和黃萎病尤為突出。自九十年代起，有設計出上述四種病害的特異性引物，建立了分別針對這幾種病害檢測技術，并應用于這些病害的調查和監測?！颈狙芯壳腥朦c】 傳統的動態分析主要基于發病情況調查及病原菌分離結果，但基于分子檢測的多病原侵染動態研究報道較少。研究利用已報道的棉花四種主要病原菌的特異性引物及其檢測體系，對人工接種后分期采集的單株病樣進行特異性引物PCR檢測?！緮M解決的關鍵問題】通過各時期病株檢測結果，分析四種病原菌準確的侵染時間及對各自在棉株內的消長動態。通過人工接種實驗，對不同時期的棉苗進行PCR檢測，通過動態分析確定最佳防治時期，為病害高效防控提供依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株

選取新疆棉花病樣中已分離純化并經致病力測定后確定的4種病原菌各3個菌株，總計12個菌株：分別是立枯絲核菌3個菌株(菌株號：RBHS15-112、RAKP15-211、RJHBBT)、尖孢鐮孢霉3個菌株(菌株號：FKBC15-112、Fksf15-212、FAKS15-112)、串珠鐮孢霉3個菌株(菌株號：FBYL15-111、FKYPH15-111、FKYC15-111)、大麗輪枝菌3個菌株(菌株號：VBV811-41、V991、VLT7-4)，所有菌株均由新疆農業大學農學院作物病害實驗室分離、鑒定并提供。用作分子檢測體系的建立及檢測過程中的陽性對照。以及病原分離中常出現的非致病菌株：鏈格孢霉(菌株號：An11-23、An11-45)、茄腐鐮孢霉(菌株號：FS12-93)、黑曲霉(菌株號：Aa15-8)、匍枝根霉(菌株號：RN12-95)，由新疆農業大學植物病理實驗室分離、鑒定并提供，用于引物特異性檢測。

1.1.2 設備與試劑

(650×260×210)mm的盆缽45個、離心管、蒸餾水、PCR擴增儀(VERITI 2.0)、高速冷凍離心機(AIIegra 25R)、組織研磨儀(Schwing mühle TissueLyser 2)、電泳儀(DYCP-31DN)、凝膠成像系統(G:BOXEF)、紫外透射儀(WD-9403C)、植物基因組DNA提取試劑盒(EE111-02)、2×TaqPCR Master mix、ddH20等。

1.1.3 供試培養基

供試培養基為PDA斜面培養基和平板培養基，用于各菌株的保存和擴繁。

1.1.4 供試麥粒菌種

選取健康飽滿的麥粒，將麥粒浸泡12 h左右后沖洗干凈，裝入200 mL三角瓶中，加入少量葡萄糖溶液，封口后放入滅菌鍋中，高溫滅菌1 h。放置至常溫后分別接入各菌株的病原菌，25℃培養7～12 d(大麗輪枝菌12 d，其他病原菌7 d)后備用。

1.2 方 法

1.2.1 接種及調查

小區試驗棉花品種為新陸早46號，將各病原菌3個菌株的麥粒菌種按種別等比混合成4種病原菌的接種用菌；與無菌土等比混合成4種病原菌混合菌土(菌土比4×0.25%)，攪拌均勻后，分裝于育苗缽內，然后在菌土中播入棉種，以不接菌的滅菌土為對照。播種時間為2018年5月5日，試驗地點在作物病害實驗室內。

1.2.2 樣品采集

自2018年5月15日出苗后起，每5 d，按整行采取棉株，每次采集15株，共采集12次，直到蕾鈴期(共采樣180株)，棉株采集后，經沖洗，分單株剪取根莖部組織(如有病痕盡量剪取病變組織)于錐型離心管(φ=1.5 mL)中備用。用于致病菌動態檢測的樣品分為五個時期即子葉期、一葉期、三葉期、六葉期、蕾鈴期。

1.2.3 檢測體系的建立1.2.3.1 病原菌DNA 提取

將菌株接種于PDA平板培養基上，27℃恒溫培養7～12 d后，刮取菌絲約0.3 g放入錐形離心管(φ=1.5 mL)中，40℃下烘12 h，置于研缽中，加液氮研磨，然后按李煥宇改良后CTAB法進行菌株DNA的提取[7]。

1.2.3.2 特異性引物的篩選

通過文獻收集供試引物，并經引物特異驗證后優選的四種主要病原菌的四對特異性引物[8-12]，分別為：劉萍花等[13]2015年設計的立枯絲核菌特異性引物RSF/RSR，K. A. Abd-Elsalam等2006年設計的尖孢鐮孢霉特異性引物Fov1-Eg-f/ Fov1-Eg-r[14]，龐莉2005年設計的大麗輪枝菌特異性引物VDS-F/VDS-R[15]和Murillo I1998年設計的擬輪枝鐮孢霉特異性引物FUS1/FUS2[16]。四種引物均由上海生工生物工程技術有限公司合成、提供。表1

表1 經驗證后的四種病原菌特異性引物
Table 1 Confirmed specific primers for four species of pathogens

引物名稱Primer引物序列(5'-3')DNA sequence of primer檢測對象Detection object片段大小Fragment size /bp退火溫度TM/℃來源sOurceRSFGCACACTCTTCTCTTTCATCCA立枯絲核菌RSRTTAGAAGCGGTTCGTCTGCAR. solaniFov1-Eg-f CCACTGTGAGTACTCTCCTCG尖孢鐮孢霉Fov1-Eg-r CCCAGGCGTACTTGAAGGAACF. oxysporumFUS1CTTGGTCATGGGCCAGTCAAGAC擬輪枝鐮孢霉FUS2CACAGTCACATAGCATTGCTAGCCF. verticilliodesVDS-FCACATTCAGTTCAGGAGACG大麗輪枝菌VDS-RCCGAAATACTCCAGTAGAAGGV. dahliae54159438621 6006052056上海生工生物工程技術有限公司

1.2.3.3 樣品總DNA 提取及檢測

將剪碎的樣株組織置于1.5 mL離心管中，加入2個鋼株(?=3.0 mm)，經組織研磨儀研磨28/s，2～3 min研磨后，參照植物總DNA 提取試劑盒(EE111-02)上的操作說明進行樣品DNA的提取。

1.3 數據處理

利用建立的檢測體系和4對特異性引物，逐一加入各對引物對每個單株樣品DNA進行PCR擴增、電泳，記錄每一單株樣品與4對特異性引物的反應結果。統計各病原菌在樣株中的陽性檢出率，以及兩種以上病原菌的各種組合在單一病株中混合侵染的檢出株率。

2 結果與分析

2.1 PCR反應體系的驗證及檢測體系的建立

用4對特異性引物分別對四種病原菌DNA和部分病株DNA樣品進行的PCR檢測試驗，研究表明，RSF/RSR、FUS1/FUS2、VDS-F/VDS-R和Fov1-Egf / Fov1-Egr這4對引物僅在4種病原菌(立枯絲核菌(R.solani)、擬輪枝鐮孢霉(F.verticilliodes)、大麗輪枝菌(V.dahliae)和尖孢鐮孢霉(F.oxysporum))DNA樣品中分別擴增出約541 bp、1 600 bp、520 bp和438 bp特異性片段；對4種病原菌的混合菌的PCR中也均擴增出與所用引物相對應的特異性片段；而陰性對照及其它非病原菌菌株和健康植株樣品均無任何擴增產物，經分析其檢測靈敏度小于0.5 ng/μL。

該反應體系下這4對引物對四種病原菌分別具有較強的特異性，且不受寄主DNA的干擾，能夠從病株中檢測到與感染菌相應的特異性條帶，該體系可以作為田間病株的檢測體系。圖1、表2、表3

表2 PCR反應體系
Table 2 PCR reaction system

25 μL反應體系5 μL reaction system(μL)2x tap PCR Mastermix13ddH2O910 μmol/L上游引物Upstream primers 10 μmol/L110 μmol/L下游引物 Downstream primers10 μmol/L1植株總DNA Total plant DNA 1

表3 四種特異性引物的PCR反應程序
Table 3 Four kinds of primer PCR reaction program

步驟 step溫度(℃)TM/℃時間Time循環數Cycle number預變性Pre-denaturation953 min變性Denaturation9445 s退火AnnealingFov1-Egf/Fov1-Egr621 minVDS-F/VDS-R5650 sRSF/RSR5945 sFUS1/FUS26045 s32延伸 Extension721 min再延伸Final extension7210 min保存 Keep4

A：引物FUS1/FUS2的特異性檢測；B：引物Fov1-Egf/ Fov1-Egr的特異性檢測；C：引物VDS-F/VDS-R的特異性檢測；D：引物RsF/RsR的特異性檢測；M：2 000 bpLadder maker；1～9：擬輪枝鏈孢霉(F.verticilliodes)、尖孢鐮孢霉(F.oxysporum)、大麗輪枝菌(V.dahliae)、立枯絲核菌(R.solani)、鏈格孢霉(A. Nees)、茄腐鐮孢霉(F.solani)、黑曲霉(A.niger)、匍枝根霉(R. stolonifer)、混合樣品；CK：健康植株的基因(陰性對照)

A: The specificity detection of primers FUS1/FUS2; B: The specificity detection of primers Fov1-Egf/ Fov1-Egr; C:The specificity detection of primers VDS-F/VDS-R; D: The specificity detection of primers RsF/RsR; M:2,000D ladder Maker; 1-9: Fusarium verticilliodes held、Fusarium oxysporum f.p. vasinfectum(At K)Snyd et Hans)、Verticillium dahliae Kleb.、Rhizoctonia solani Kuh.、Alternaria Nees、Fusariumsolani、Aspergillusniger、Rhizopusstolonifer、Mixed sample; CK: Health tissue of maize(negative control).

圖1 四對引物檢對4種病原菌的特異性反應
Fig.1 Specific response of four pairs of primers to four pathogens

2.2 人工接菌后病原菌侵染動態

研究表明，四種病原菌在人工接種條件下，從子葉期到蕾鈴期均能侵染棉苗；4種病原菌侵染動態相比較，立枯絲核菌侵染相對較早、較快，播種后10 d 即有26.7%的檢出株率；擬輪枝鐮孢霉次之，播種后 10 d即有13.3%的檢出株率；立枯絲核菌、擬輪枝鐮孢霉兩種病原菌的侵染動態均表現出前期檢出株率漸增，一葉期末到三葉期達到高峰，并以此為轉折，以后檢出株率降低，以幼苗期侵染為主要特點；而尖孢鐮孢霉和大麗輪枝菌，雖從子葉期開始即可能侵染，但在子葉期至一葉期侵染株率較低(尖孢鐮孢霉在播種后10～25 d 有6.7%～20%的檢出株率，大麗輪枝菌在播種后15～25 d 有6.7%～13.3%的檢出株率)，但從子葉期到蕾鈴期兩種病原菌的侵染株率呈漸增趨勢，到蕾鈴期趨于平緩，以整個生育期均可侵染為害為特點。

在四種病原菌等量接菌條件下立枯絲核菌侵染最快，早期侵染率最高，擬輪枝鐮孢霉次之；立枯絲核菌、擬輪枝鐮孢霉和尖孢鐮孢霉的初侵染期相對較早，在播種后10 d 即可侵染，大麗輪枝菌的始侵染期稍晚，在播種后15 d；作為苗期病害病原菌的立枯絲核菌和擬輪枝鐮孢霉之間，從子葉期到蕾鈴期的各生育期中，立枯絲核菌的侵染株率總體上高于擬輪枝鐮孢霉；作為維管束病害病原菌的尖孢鐮孢霉和大麗輪枝菌之間，從子葉期到六葉初期，尖孢鐮孢霉的侵染株率始終高于大麗輪枝菌，而六葉期到蕾鈴期大麗輪枝菌的侵染株率高于尖孢鐮孢霉。圖2

圖2 混合接種后四種病原菌在棉株中的消長動態
Fig. 2 Dynamics of growth and decline of four pathogens in cotton plants after mixed inoculation

2.3 四種病原菌間的混合侵染

對人工接種后動態采樣及各樣品檢測結果統計分析可知，未檢測到病原菌侵染的植株占總檢測株數的28.33%；受到單一病原菌和多種病原菌侵染的檢出株率為71.67%，其中，兩菌混合侵染的檢出株率為31.67%，3菌混合侵染的檢出株率為11.67%；4菌混合侵染的檢出株率為0；兩菌及兩菌以上混合侵染的檢出株率為43.33%。說明混合侵染普遍存在，以兩菌混合侵染比例較高。表4，圖4

圖3 基于子葉期到蕾鈴期不同病原菌組合總檢出率的單一侵染與混合侵染對比
Fig.3 Comparison of single infection and mixed infection based on total detected rate of different pathogen combinations from cotyledon stage to bell stage

對不同生育期不同菌種組合的混合侵染檢出株率進行統計的結果顯示,混合侵染比率與總的檢出率及病害高峰期呈正相關，各病原菌的檢出率低時，其混合侵染的比率也低，如子葉期和一葉期；各病原菌檢出率高時，其混合侵染的比率也較高，如三葉期；4種病原菌的組合中，立枯絲核菌和擬輪枝鐮孢霉、立枯絲核菌和尖孢鐮孢霉，尖孢鐮孢霉和大麗輪枝菌，以及立枯絲核菌和擬輪枝鐮孢霉和尖孢鐮孢霉等組合在各單株樣品中有相對較高的檢出株率，這些菌種之間較易形成混合侵染。表4

表4 各生育期棉株中不同病原菌組合的檢出株率
Table 4 The detected rate of different pathogens combinations in cotton plants at various growth stages

病原菌種類Pathogen species不同生育期檢出率Detected rate at different growth stages(%)子葉期*Cotyledon stage一葉期*One-leaf stage三葉期*Three-leaf stage六葉期**Six-leaf stage蕾鈴期**Bell stage總檢出率***The total detected rate(%)Rs10.00 16.67 13.33 8.89 2.22 9.44 Fv6.67 10.00 20.00 4.44 0.00 7.22 Fo0.00 0.00 3.33 6.67 6.67 3.89 Vd0.00 0.00 0.00 11.11 20.00 7.78 單菌檢出率16.67 26.67 36.67 31.11 28.89 28.33 Rs+Fv6.67 10.00 10.00 4.44 4.44 6.67 Rs+Fo6.67 3.33 6.67 8.89 6.67 6.67 Rs+Vd3.33 6.67 6.67 4.44 4.44 5.00 Fv+Fo0.00 6.67 3.33 4.44 4.44 3.39 Fv+Vd0.00 0.00 10.00 6.67 2.22 3.89 Fo+Vd0.00 0.00 3.33 8.89 11.11 5.56 兩菌檢出率16.67 26.67 40.00 37.78 33.33 31.67 Rs+Fv+Fo3.33 6.67 10.00 2.22 4.44 5.00 Rs+Fo+Vd0.00 3.33 3.33 4.44 2.22 2.87 Rs+Fv+Vd0.00 3.33 3.33 2.22 2.22 2.22 Fv+Fo+Vd0.00 0.00 0.00 4.44 2.22 1.76 三菌檢出率3.33 13.33 16.67 13.33 11.11 11.67 Fo+Fv+Rs+Vd0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00

注：Rs：立枯絲核菌；Fv：擬輪枝鐮孢霉；Fo：尖孢鐮孢霉；Vd：大麗輪枝菌；*：子葉期、一葉期、三葉期各期采樣2次，各期檢測30株；**：六葉期至蕾鈴期各期采樣3次，各期檢測45株；***：各生育期合計180個單株樣品中的檢出率

Note: Rs:R.solani; Fv:F.verticilliodes; Fo:F.oxysporum; Vd :V.dahliae;*：The cotyledonary stage, one-leaf stage, and three-leaf stage were sampled twice, and 30 strains were tested in each stage;**：The six-leaf stage to the bell stage were sampled three times, and 45 strains were tested in each stage;***：The detected rate of 180 individual samples in total growth period

3 討 論

3.1 在4種病原菌混合接種條件下，立枯絲核菌、擬輪枝鐮孢霉、尖孢鐮孢霉和大麗輪枝菌從子葉期到蕾鈴期均能侵染棉苗；4種病原菌中立枯絲核菌侵染相對較早、較快；擬輪枝鐮孢霉次之；立枯絲核菌、擬輪枝鐮孢霉兩種病原菌的侵染動態曲線均呈單峰形式，一葉期末到三葉期為侵染高峰，前期侵染株率從低到高漸增，后期從高到低漸減，以幼苗期侵染為主要特點；而尖孢鐮孢霉和大麗輪枝菌兩種病原菌從子葉期到蕾鈴期的侵染株率呈漸增趨勢，到蕾鈴期趨于平緩，以整個生育期均可侵染為害為特點。

3.2 在4種病原菌等量接菌條件下立枯絲核菌侵染最快，早期侵染率最高，擬輪枝鐮孢霉次之；立枯絲核菌、擬輪枝鐮孢霉和尖孢鐮孢霉的始侵染期相對較早，大麗輪枝菌的始侵染期稍晚；從子葉期到蕾鈴期立枯絲核菌的侵染株率總體上高于擬輪枝鐮孢霉；從子葉期到六葉期，尖孢鐮孢霉的侵染株率高于大麗輪枝菌，而六葉期到蕾鈴期大麗輪枝菌的侵染株率高于尖孢鐮孢霉。

4種病原菌中，兩菌及兩菌以上的混合侵染普遍存在，以兩菌混合侵染比例較高?；旌锨秩颈嚷逝c總的檢出率及病害高峰期呈正相關；4種病原菌之間，立枯絲核菌和擬輪枝鐮孢霉、立枯絲核菌和尖孢鐮孢霉，尖孢鐮孢霉和大麗輪枝菌，以及立枯絲核菌和擬輪枝鐮孢霉和尖孢鐮孢霉較易形成混合侵染。

3.3 棉花土傳病害的主要病害種類較多，其中以立枯病、紅腐病、枯萎病、黃萎病為害較為嚴重。這4種病害均侵染根和根莖部，有的癥狀明顯易區別，有的癥狀隱蔽不易區別；立枯病和紅腐病屬苗期病害，枯萎病和黃萎病屬維管束病害，各自的侵染動態有一定的差異。而準確把握病害發生動態是選擇最佳防治時期的關鍵。傳統的田間發生動態調查，主要基于病害癥狀的識別或分離鑒定結果，容易出現一些判斷上的誤差，特別是對于可能產生多病原混合侵染的情況，較難準確判斷病株中的病原種類和進行混合侵染分析。研究采用分子檢測方法，可較為準的檢測到成功侵入并有一定增殖量的多種病原菌，對于提高調查的準確性，特別是在多病原混合侵染分析方面有較大的優勢，但也在一定程度上受到靈敏度的影響，可能出現一些病原菌侵入時間短，增殖量較少或取樣偏離病點而漏檢的情況。

研究結果中，尖孢鐮孢霉和大麗輪枝菌引起的這兩種病害檢出率呈逐漸上升的變化趨勢。這一趨勢與李國英[5]基于病情指數變化的田間棉花枯萎病和黃萎病發生和流行動態分析結果基本一致，但在峰值出現時間和峰值出現次數上有一些差異，主要原因是研究在室內進行，溫度相對穩定，調查期只有60 d，受變溫影響較小。此外，研究中采用了4種病原菌等量混合接種，其接種壓力較田間自然接種壓力大，能反映用4種病原菌同時存在并相互影響的情況下，各病原菌的侵染動態及混合侵染情況，雖然與田間自然接種情況有些差異，但能在一定程度上反應出病原菌之間的影響，為進一步的病害與病害間的關系研究奠定基礎。

4 結 論

4種棉花土傳病害病原菌均能從子葉期開始侵染，而侵染初期是多數病害防治的有利時機，為了減少早期侵染應盡早防治，防治四種病害的最佳時機和最佳方法是在播種前用4病兼防的藥劑進行種子處理或種子包衣。