應用精子-透明質酸結合試驗評價精液質量的可行性

徐杰偉，陳美玲，廖黎黎，黃永漢

（佛山市第一人民醫院生殖醫學中心，廣東佛山528000）

透明質酸是一種高分子量的黏多糖（糖胺聚糖），也是卵母細胞透明帶基質的主要成分［1］。成熟的精子頭部表面有透明質酸的受體，容易與卵細胞結合。精子-透明質酸結合率可反映精子的成熟度。精子-透明質酸結合試驗試劑盒作為二類體外診斷試劑，目前正在做臨床試驗評價其檢測性能，且國內尚無同類產品正式上市。佛山市第一人民醫院生殖醫學中心是精子-透明質酸結合試驗試劑盒臨床評價試驗點之一。本研究通過分析精子-透明質酸結合試驗結果與精液常規、精子DNA碎片率等指標間的相關性，探討其評價精液質量的臨床應用價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2018年4月至7月在佛山市第一人民醫院生殖醫學中心男科門診就診的男性患者549人，年齡19～52歲，平均31.6歲。患者選擇標準：①成年男性，年齡18～60歲；②精液常規檢查精子濃度≥20×106/mL，前向運動精子率（PR）≥10%；③標本的留取方式為手淫法或用特制的精液采集套采集。排除標準：①未禁欲_2～7 d的患者；②經精液常規檢測判斷為無精子癥患者；③精液總量＜1.0 mL的標本；④因收集或保存不當不能用于檢測的標本；⑤ 精子運動力過低者（PR＜10%）；⑥以性交方式留取標本的患者。所有研究對象均簽署知情同意書，并得到我院倫理委員會同意。

1.2 精液標本采集及常規分析

所有研究對象均禁欲2～7 d，在生殖醫學中心取精室內通過手淫法采集精液標本于無菌取精杯中，經電子天平稱量精液體積，放置于37℃恒溫板，待精液完全液化后，按《WHO人類精液檢驗與處理實驗室手冊（第五版）》標準［2］，用計算機輔助精液分析儀（美國HAMILTON THORNE IVOS，CASA）檢測精子相關參數；用精密pH值試紙測定精液pH；用深圳華康生物醫學工程有限公司提供的巴氏染色液進行精液涂片染色，在光學顯微鏡下進行精子形態學分析。

1.3 精子DNA完整性檢測

采用精子染色質擴散試驗（sperm chromatin dispersion test，SCD）檢測精子DNA的完整性，試劑盒由深圳華康生物醫學工程有限公司提供，檢測過程嚴格按說明書操作。在普通顯微鏡高倍視野下，觀察400個染色的精子，按判斷標準計算精子DNA的完整率。精子DNA碎片率（%）=1-DNA完整率，表示精子DNA損傷程度。

1.4 精子-透明質酸結合試驗

①在包被載玻片的“T”孔（測定孔）內加入液化的精液10μL，置于20～30℃的室溫或恒溫平臺至少反應10 min，但不要超過20 min。②普通光學顯微鏡或相差顯微鏡40倍物鏡下觀察結果，計數“T”孔內500個活動精子，記錄精子尾部持續鞭打但頭部被結合在玻片表面難以自由前行的精子數量（成熟精子），不被結合的精子則呈現活動力不受限的自由運動狀態。精子-透明質酸結合率（%）=（被結合精子數÷計數活動精子總數）×100%。試劑盒給定的正常參考值為≥58.5%［3］。

1.5 統計學分析

應用SPSS 18.0軟件包進行實驗數據處理，數據采用均數±標準差（xˉ±s）表示，兩組比較采用t檢驗；采用Pearson相關分析精子-透明質酸結合率與各項指標的相關性，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 精子-透明質酸結合試驗檢測結果

549例患者精子-透明質酸結合率測定范圍為9%～89%，平均56.5%。其中275例結合率＜58.5%設為研究組，平均年齡（31.8±5.6）歲；274例結合率≥58.5%設為正常對照組，平均年齡（31.4±5.1）歲。

2.2 兩組間精液常規參數、精子DNA碎片率比較

結果見表1。對照組的精子質量要優于研究組。兩組間精液pH、精子濃度、前向運動百分比、頭部缺陷率、殘留胞質、活動率、正常形態率的比較有顯著性差異（P＜0.05）；但精液體積、精子DNA碎片率間差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 兩組精液常規參數、精子DNA碎片率比較

2.3 精子-透明質酸結合率與其他指標的相關性

相關性分析結果顯示，精子-透明質酸結合率與精子濃度（r=0.230，P=0.000），活動率（r=0.254，P=0.000），正常形態率（r=0.261，P=0.006），前向運動百分比（r=0.245，P=0.000）呈正相關；與頭部缺陷率（r=-0.248，P=0.009），殘留胞質（r=-0.219，P=0.022），精液 pH（r=-0.145，P=0.001）呈負相關；與精子DNA碎片率無明顯相關性（r=0.010，P=0.864）。

3 討論

精子-透明質酸結合試驗作為一項新的評價精子成熟度的實驗，已經逐漸在臨床得到開展。成熟精子容易與卵細胞透明帶結合，實現穿透與受精；不成熟的精子不具備與透明質酸結合的能力，預示著精子成熟障礙［3］。本研究測定了549例患者的精液標本，結果顯示精子-透明質酸結合試驗具有良好的測定區間，其測定范圍是9%～89%。本組資料結果也顯示精子濃度、活動率、正常形態率、頭部缺陷率和殘留胞質等指標對照組均優于研究組，而精液體積、精子DNA碎片率間的差異無統計學意義。相關性分析結果顯示精子-透明質酸結合率與精子濃度、前向運動百分比、活動率、正常形態率等指標間呈正相關；與精液pH、頭部缺陷率、殘留胞質等指標間呈負相關；而與精子DNA碎片率無顯著相關性。

Huang等［4］研究發現，精子-透明質酸結合試驗選出的精子與胚胎學家根據傳統形態學標準在顯微鏡下挑選出的精子的DNA完整性無顯著的差異；Cohen-Bacrie等［5］測定1 600多例標本的研究結果顯示，精子DNA損傷與快速前向運動、精子存活率無相關性；上述研究提示活動精子與DNA完整性間無顯著性相關性，這與本研究的相關結果基本一致。

Nijs等［6］報道精子-透明質酸結合率與精子的形態、濃度和活力無關；劉瑜等［7］報道精子-透明質酸結合率與核蛋白組型轉換異常率、精子DNA碎片率指標間存在較弱的負相關性，核蛋白組型轉換率與精子DNA碎片率間呈正相關；亦有研究［8-9］認為成熟障礙的精子DNA碎片率高。這些研究均與本研究結果不一致，可能與精子-透明質酸結合試驗檢測的只是精液中的活動精子或研究對象入選標準不同有關。

Worrilow等的研究［10］表明，并非所有的活動精子都能結合透明質酸，與透明質酸結合的精子有著較為完整的DNA和染色體，精子質量好；相比于不能與透明質酸結合的精子，能與透明質酸結合的精子生育功能更強。Liu等［11-12］研究表明，受精失敗多數是因為精子缺陷導致精子不能結合和穿透卵細胞透明帶引起。

綜上，精子-透明質酸結合試驗敏感性好，能反映精子功能，精子-透明質酸結合率與精液質量具有良好的相關性，可以作為臨床評價男性生育力的指標之一。