顫抖蛋白異構體7在乳腺癌中的表達及其與患者預后的關系

徐振雷，王慶偉

（南京醫科大學附屬淮安第一醫院1.燒傷整形科，2.檢驗科，江蘇淮安223001）

qkI基因編碼一組RNA結合蛋白的剪接異構體，主要調控細胞分化［1-2］。在神經祖細胞、肌細胞和單核細胞中，顫抖蛋白（Quaking，QKI）異常表達可導致細胞發生嚴重的分化缺陷［3-4］。qkI基因編碼3個主要的RNA結合蛋白，QKI-5，-6和-7，其C末端30個氨基酸不同；QKI-5 C端含有核定位序列，主要定位于細胞核中，QKI-6分布在整個細胞中并與QKI-5形成異源二聚體，QKI-7主要定位于細胞質中［5］。QKI可作為預測結腸癌、肺癌、口腔癌和胃癌預后的生物標志物［6-9］，QKI-5通過Ras-MAPK信號通路抑制腎透明細胞癌的增殖和誘導細胞周期停滯［10］，也可以預測前列腺癌患者的預后［11］。但是，QKI-7在乳腺癌發生發展過程中的作用尚不清楚。本研究擬觀察QKI-7在乳腺癌組織中的表達，并分析其與患者預后之間的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料與試劑

組織芯片購于上海芯超生物有限公司，共142例原發性乳腺癌組織及對應癌旁組織（距離腫瘤邊緣＞5.0 cm）。所有患者臨床病理資料和隨訪資料均完整，均為女性，年齡29～83歲，平均53.3歲；腫瘤直徑為0.5～15.0 cm，平均3.5 cm；其中，淋巴結轉移90例；組織學類型：浸潤性導管癌134例，浸潤性導管癌伴浸潤性小葉癌7例，篩孔癌1例；根據美國癌癥聯合會（AJCC）乳腺癌TNM分期標準：Ⅰ期12例，Ⅱ期83例，Ⅲ期47例。手術前均未經過放射治療、化學治療和靶向藥物治療，無遠處轉移；患者接受乳腺癌保乳手術或乳腺癌根治手術，手術時間為2001年1月至2004年8月，隨訪時間截止到2013年7月，隨訪9～13年。

小鼠抗人單克隆抗體QKI-7（上海文淵閣生物科技有限公司）；小鼠抗人P53和Ki-67抗體（美國Sigma公司）；兔抗小鼠二抗購于上海威奧生物科技有限公司；通用型免疫組化檢測試劑盒購于吉泰生物有限公司。

1.2 免疫組織化學檢測QKI-7、P53和Ki-67的表達

采用SP免疫組織化學染色法，將組織芯片在80℃微波中加熱20 min；二甲苯浸泡脫蠟15 min；50%、70%、80%、95%梯度乙醇水化各2 min；PBS沖洗3次，每次5 min；3%過氧化氫固定10 min；置于95℃0.01mol/L枸櫞酸緩沖液（pH=6.0）中煮沸15 min，行抗原修復；滴加正常山羊血清室溫封閉20min；滴加小鼠抗人QKI-7（1∶2 000）、P53（1∶1 000）、Ki-67（1∶1 000），4℃孵育過夜；滴加兔抗小鼠二抗（1∶1 000）室溫孵育 2 h；PBS洗 3次，每次 5 min；DAB顯色，脫水、透明、封片、鏡檢；用PBS代替一抗作為陰性對照，用已知陽性片作為陽性對照。

1.3 免疫組織化學結果判定

將組織芯片置于光鏡下觀察和評分，結果判斷綜合考慮低倍鏡下陽性細胞的染色強度和高倍鏡下陽性細胞所占比例。染色強度和陽性細胞百分比評分標準：基本不著色為0分，淡黃色1分，棕黃色2分，黃褐色3分。組織芯片置于顯微鏡下計數200個細胞，陽性細胞百分數＜10%為0分；10%～40%為1分；40%～70%為2分；≥70%為3分。兩者相加，0～2分為陰性；3～6分為陽性［12］。由2位有資質的病理科醫師采用雙盲法進行判讀，陰陽性判斷不一致時，以第三位病理科醫師的判讀結果為準。

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0進行統計學分析，QKI-7、P53及Ki-67在乳腺癌和癌旁組織中的陽性率比較采用χ2檢驗，QKI-7與P53和Ki-67表達相關性采用Spearman等級相關分析，乳腺癌組織中QKI-7的陽性率與各臨床病理參數的相關性采用Pearson、Fisher精確檢驗和似然比檢驗。采用Kaplan-Meier檢驗評估總生存期，組間生存時間的比較采用Log-Rank法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 QKI-7在乳腺癌組織及對應癌旁組織中的表達比較

免疫組織化學染色結果顯示，QKI-7主要位于細胞質中，P53和Ki-67主要位于細胞核。乳腺癌組織中QKI-7陽性表達率（28.2%，40/142）明顯低于癌旁組織（78.9%，112/142，χ2=73.378，P＜0.05）。此外，乳腺癌組織中P53陽性表達率（21.8%，31/142）明顯低于癌旁組織（93.7%，133/142，χ2=150.139，P＜0.05），Ki-67陽性表達率（54.9%，78/142）明顯高于癌旁組織（17.6%，25/142，χ2=42.791，P＜0.05）。見圖1。

2.2 乳腺癌組織中QKI-7表達與患者臨床病理參數間的關系

結果顯示，腫瘤組織中QKI-7表達與腫瘤直徑、淋巴結轉移、TNM分期及孕激素受體相關（P均＜0.05），QKI-7陽性率越低，腫瘤直徑越大，腫瘤越趨于淋巴結轉移、TNM分期越高；而與患者年齡、組織學類型、雌激素受體和HER2受體情況等無明顯相關性（P均＞0.05）。見表1。

2.3 乳腺癌組織中QKI-7的表達與患者預后的關系

將142例乳腺癌患者按QKI-7表達分為陰、陽性兩組，Kaplan-Meier分析結果顯示，QKI-7陽性患者累積生存率（87.80%）明顯高于QKI-7陰性患者（61.39%，Log-Rank檢驗，P=0.001 8）。見圖2。

圖1 乳腺癌組織和癌旁組織中QKI-7、P53和K i-67的表達（免疫組化染色×200）

表1 乳腺癌組織中QKI-7表達與患者臨床病理參數之間的關系 n（%）

2.4 乳腺癌組織中QKI-7表達與P53及Ki-67表達的相關性

相關分析結果顯示，乳腺癌組織中QKI-7表達與P53表達呈正相關（r=0.579，P＜0.05），而與Ki-67表達呈負相關（r=-0.329，P＜0.05）。見表2。

圖2 不同QKI-7表達患者的Kaplan-Meier生存曲線

表2 Spearman檢驗分析QKI-7與P53及Ki-67表達的相關性

3 討論

以往有研究顯示QKI在多種實體惡性腫瘤中表達下調，其通過抑制腫瘤細胞的生長和侵襲轉移發揮抑癌基因的作用［8，13］。本實驗結果顯示，QKI-7表達在乳腺癌組織中顯著下調，且隨腫瘤直徑增大、TNM分期升高而表達降低；此外，QKI-7在轉移乳腺癌組織中較無轉移乳腺癌組織表達更低，由此表明，QKI-7低表達在乳腺癌增殖和侵襲轉移的過程中可能發揮負面作用。孕激素受體是配體激活的核轉錄調節因子，與配體結合后移位至胞核同DNA結合，促進乳腺上皮細胞增殖和分化［14］。QKI-7與孕激素受體呈負相關，推測QKI-7異常低表達時孕激素受體促進乳腺上皮細胞過度增殖。以往研究報道，胃癌中QKI低表達與患者不良預后有關［9］，結直腸癌中QKI異常低表達促進患者術后的復發，同時也是患者術后復發的獨立危險因素［6］。本實驗生存分析發現，QKI-7陽性表達患者總生存率顯著高于QKI-7陰性表達者，說明QKI-7可以作為乳腺癌患者的不良預后標志物。

Ki-67是衡量細胞增殖活性的生物學標志物，Ki-67高表達的乳腺癌患者預后較差［15］。P53是最早發現的抑癌基因之一，同時也是腫瘤中最常發生突變的基因，在約50%的惡性腫瘤中發生突變［16］。本實驗結果顯示，與癌旁組織相比，P53在乳腺癌組織中的表達水平顯著降低，可能在乳腺癌的發生過程中發揮負面作用；而Ki-67在乳腺癌中的表達顯著升高，其可能促進乳腺癌的發生。本實驗通過相關性分析發現，乳腺癌組織中QKI-7陽性表達與細胞增殖指標Ki-67陽性表達呈弱負相關，而與P53陽性表達呈中等正相關，提示QKI-7更可能與P53共同參與乳腺癌的進展，兩者在乳腺癌發展過程中可能起協同作用，但具體作用機制還有待進一步研究證實。

綜上所述，QKI-7在乳腺癌組織中低表達，且其可能與腫瘤增殖、淋巴結轉移、TNM分期相關，提示QKI-7參與乳腺癌的發生發展；生存分析結果表明，QKI-7低表達與患者的不良預后有關，由此表明，QKI-7可作為乳腺癌患者潛在的預后標志物。今后需要在體外細胞層面和體內動物實驗中進一步驗證QKI-7與乳腺癌惡性生物學行為之間的關系，探討QKI-7參與乳腺癌發生發展的機制。