花生子葉節高效芽誘導體系的研究

馮瀅 王鳳歡 張樂 鮑紅帥 馬旭策

摘 要 花生是一種重要的油料作物，培育高產、優質、抗病、耐逆新品種是促進花生增產、增效的主要手段，但較低的花生外植體再生效率嚴重阻礙了花生基因工程的研究。因此，建立高效的花生再生體系對于科學研究具有重要意義。試驗以3份不同花生品種的子葉節作為外植體，探究不同預培養天數和不同濃度的不同植物激素對子葉節叢生芽分化的影響。結果表明：預培養5d的子葉節芽誘導情況最好。不同品種進行激素誘導培養時也有一定的差異規律：麻油1-1和弗落蔓生的子葉節外植體在MSB5+6 mg·L-1 6-BA+2 mg·L-1 2，4-D培養基中誘導芽效果最好;濮花23號的子葉節最佳誘導芽培養基是MSB5+10 mg·L-1 6-BA+2 mg·L-1 2，4-D。

關鍵詞 花生子葉節;再生體系;植物激素

中圖分類號：S565.2 文獻標志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.09.024

花生（Arachishypogaea L.）屬于豆科蝶形花亞科落花生屬，是一種重要的油料作物。培育高產、優質、抗病、耐逆的花生新品種是促進花生增產、增效的主要手段。中國雖通過常規育種手段育成了一大批花生新品種，促進了花生產業的發展，但在育種過程中也遇到了一些問題：育成品種的遺傳基礎狹窄，一些野生品種由于雜交不親和、雜種不育等因素導致其優良性狀利用困難，而生產上迫切需要具有抗蟲、抗病等特殊性狀的新品種，采用常規雜交育種手段很難實現[1]。

花生組織培養對于品種改良、新品種繁殖、遺傳轉化和種質保存等具有重要意義[2]。組織培養至今已有多年，取得了不斐的成績，而花生各部分的再生研究也獲得了較大進步，如下胚軸[3]和胚小葉[4]。隨著花生組織培養研究的發展，已有不少科學研究者對于初始的組織培養的材料方法進行了更深一步的探索和方法改進。例如，Sharma和Anjaiah[5]報道了一種利用成熟子葉外植體在MS培養基[6]上添加6-BA和2，4-D培養出不定芽的有效方法。尤淑麗[7]選用外引及自選共8個花生品種胚小葉作為外植體，研究愈傷組織誘導率和不定芽分化率，結果表明，品種間愈傷組織誘導率和不定芽分化率差異顯著。蔣菁等[8]以3日齡胚小葉、下胚軸和子葉節為外植體，對花生的體胚誘導做了大量研究，結果表明，胚小葉容易誘導體細胞胚，而胚軸和子葉未發現體細胞胚的形成，濃度為10 mg·L-1的2，4-D和濃度為5 mg·L-1的6-BA有利于體細胞胚分化成苗，成苗培養基中添加5～15 mg·L-1的GA3利于提高體細胞胚的成苗率。Emelie等[9]在研究影響油料作物芽再生的因素時，成功開發了一種高效的芽再生轉化原球莖。Shan等[10]以華北地區常見的9個花生品種為外植體，建立了一套有效的外植體器官發生體系，可用于基因改造后的轉化再生，在遺傳改良工程中具有一定的應用價值。

由于豆科植物的再生難度較大且有種屬特異性，研究進展較為緩慢，特別是如何建立高效、穩定、能夠連續獲得再生植株的體系仍需要更進一步研究[11]。本研究以3個花生栽培品種為材料，探究以子葉節為外植體的植株再生技術，分析不同預培養時間、激素組合在花生子葉節再生體系培養中的影響，從而建立花生子葉節的高效再生體系。

1 材料及方法

1.1 材料

材料為花生品種麻油1-1、弗落蔓生和濮花23號，以上品種在河北農業大學花生研究所種質資源庫中均有保存。

1.2 方法

1.2.1 培養基配制

基本培養基、芽誘導培養基等參考文獻[12]。基本培養基為MSB5基本培養基+30 g·L-1+7.9 g·L-1（MSB5培養基是由MS培養基的大量元素，微量元素，鐵鹽成分加上B5培養基有機成分而成）;芽誘導培養基MSB5+6 mg·L-1 6-BA+2 mg·L-1 2，4-D，pH 5.8。

1.2.2 試驗過程

選用品相好的花生種子，浸于75%酒精中1 min后，再在0.1%的HgCl2溶液中浸泡15 min，然后用無菌水漂洗4～5次，剝去種皮接種于MSB5培養基上進行種子萌發。分別各取在培養基上萌發3 d、5 d、7 d的花生無菌子葉節外植體3組，每組80個;9 d的花生無菌子葉節外植體3組，每組78個。接種到芽誘導培養基上進行誘導，30 d左右統計芽誘導情況。

將萌發5 d的無菌種子苗子葉節無上表皮一端接觸培養基接種在6-BA濃度分別為2 mg·L-1、4 mg·L-1、6 mg·L-1、8 mg·L-1和10 mg·L-1，2，4-D濃度為2 mg·L-1的不同處理的芽誘導培養基上，每個處理60個外植體3次重復，培養1個月后調查叢生芽分化率。

2 結果

2.1 不同預培養時間對子葉節外植體誘導的影響

表1顯示，在培養基上萌發3 d、5 d、7 d及9 d的子葉節都能被誘導形成叢生芽，但是芽的分化頻率存在著明顯差異。在所有處理中，培養5 d的無菌苗子葉節的分化頻率最高、子葉節外植體的再生能力最強，分化頻率為72.08%。此外，通過觀察得出，培養5 d的無菌苗的子葉變大，變綠，上胚軸稍有長出，此時獲得的子葉節是用于誘導叢生芽產生的較好材料。因此，在以花生子葉節為外植體進行轉化試驗時，選用培養5 d的無菌苗獲得子葉外植體。

2.2 不同激素濃度子葉節芽誘導結果

同一種植物不同的基因型在外植體組織的誘導和芽分化的過程中對激素的要求不同，其中所需要的激素濃度水平取決于其內源激素的水平。所以不同品種進行激素誘導培養時有不同的差異規律。

由表2結果可知，不同濃度6-BA和2，4-D激素組合配比對三種花生品種的芽誘導率不同，其中麻油1-1誘導率最高的的組合是6-BA的濃度為6 mg·L-1，2，4-D的濃度為2 mg·L-1，芽分化率達到83.33%;弗落蔓生誘導率最高的的組合是6-BA濃度為10 mg·L-1，2，4-D濃度為2 mg·L-1，芽誘導率達到83.34%;濮花23誘導率最高的的組合是6-BA濃度為10 mg·L-1，2，4-D濃度為2 mg·L-1的誘導率為71.11%。在此基礎上，6-BA的濃度過高或過低都會抑制芽的分化，可知細胞分裂素與生長素的比例是激素使用的關鍵，因此選用最佳的組合才能提高再生效率。

3 結論與討論

外植體芽誘導過程即外植體先脫分化后再分化的過程，中間涉及到的植物激素是植物生長素和細胞分裂素，合適的生長素和細胞分裂素比例能夠促進外植體叢生芽的誘導發生，反之，則會有抑制效果。一般而言，花生再生能力受基因型影響較大，因此找到合適的激素配比是高效再生體系建立的根本。

Tiwari V等[13]利用當地品種GG-20的去胚子葉為外植體，進行組織誘導培養，結果表明，在培養基中加入66.6 μM的6-BA的再生效果最好，再生率達到52.69%±2.32%，同時該外植體在誘導培養基20 μM 6-BA+10 μM 2，4-D中有很高的發芽率，為17.67%±3.51%。本試驗所得結果與以上研究不一致，這可能與所選品種不同有關。本研究建立了麻油1-1、弗落蔓生、濮花23號的高頻再生體系，利用花生子葉節為外植體，在誘導培養基中加入濃度為6 mg·L-1的6-BA、2 mg·L-1的2，4-D，叢生芽誘導率平均達70%以上。再生體系用花生子葉節為外植體，取材方便;所用的培養基為基本的MSB5培養基、激素種類少;誘導成芽只需要1個月，時間短。此外，此再生體系明顯優于其它體系之處在于：花生子葉節營養豐富，誘導得到的叢生芽生長健壯，成苗快。

細胞全能性是植物活細胞具有的特性，不同基因型的物種決定了各種性狀的差異。不同花生品種在組織培養的各個階段和各個方面幾乎都受到基因型的影響。芽發生頻率也與花生的基因型密切相關。研究表明，不同的花生品種誘導不定芽的發生率存在明顯差異。試驗發現，花生品種麻油1-1和弗落蔓生的芽誘導率較高，分別為85%和83.34%;而花生品種濮花23號的芽誘導率相對于較低，為71.11%。

參考文獻：

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（責任編輯：趙中正）