玉米芯木聚糖硫酸酯的合成、表征及其抗凝血活性

樊洪玉, 衛(wèi) 民,2*, 趙 劍, 蔣劍春

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所；生物質(zhì)化學(xué)利用國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室；國(guó)家林業(yè)和草原局林產(chǎn)化學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；江蘇省 生物質(zhì)能源與材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 南京 210042； 2.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 林業(yè)新技術(shù)研究所， 北京 100091)

半纖維素是重要的天然多糖，由于其具有良好的生物相容性、生物降解性和無(wú)毒性等特性，已廣泛應(yīng)用于食品和非食品領(lǐng)域。玉米芯中的半纖維素含量較高，半纖維素的結(jié)構(gòu)為聚木糖型。大多數(shù)的研究通常使用玉米芯為原料，采用生物化學(xué)法來(lái)提取木聚糖，但所得的木聚糖相對(duì)分子質(zhì)量較小、聚合度在2～3之間，為低聚木糖，主要作為功能性保健品[1-3]。近年來(lái)，利用玉米芯半纖維素木聚糖的生物特性來(lái)研發(fā)高附加值的化學(xué)品和醫(yī)藥產(chǎn)品得到了廣泛的關(guān)注[4-6]。臨床上常使用的抗凝血?jiǎng)┖涂寡▌楦嗡剽c，但是在使用的過(guò)程中通常存在出血和血小板減少癥的副作用[7]。有研究表明，硫酸根離子與多糖結(jié)合而成的硫酸化多糖具有優(yōu)異的血液相容性和抗凝血活性。因此，具有無(wú)健康風(fēng)險(xiǎn)的新的抗凝血和抗血栓特性的硫酸化多糖成為新的研究熱點(diǎn)[8-10]。Liang等[11]使用南瓜多糖為原料合成了硫酸化衍生物，該衍生物在較高的取代度(DS)時(shí)，可以獲得較強(qiáng)的抗凝活性。Kamitakahara等[12]合成的新型硫酸化多糖不僅具有抗凝血活性，還對(duì)黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移有抑制作用。天然木聚糖通常是具有不同結(jié)構(gòu)和生理活性的大分子的混合物，將硫酸基團(tuán)引入天然多糖是獲得具有生物學(xué)性質(zhì)的抗凝血?jiǎng)┑挠行Х绞健５嵌嗵窃谔崛≈苽溥^(guò)程中結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，并且在硫酸化改性的過(guò)程中，尤其是在強(qiáng)酸性條件下容易降解，反應(yīng)條件難于控制，制備的硫酸化多糖相對(duì)分子質(zhì)量分散系數(shù)大，分布較寬，是一個(gè)混合體，其抗凝機(jī)理和潛在功效仍在不斷探索中。因此需尋找一種適用于所用多糖原料的反應(yīng)條件溫和可控，且產(chǎn)物性能穩(wěn)定的硫酸酯化改性方法。由于木聚糖不溶于水及大部分溶劑，而在加熱的條件下可溶于非質(zhì)子溶劑DMF、DMSO、FA等。因此，本研究以玉米芯木聚糖為原料，在不同的非質(zhì)子溶劑中，通過(guò)三氧化硫-吡啶法合成了木聚糖硫酸酯，采用正交試驗(yàn)對(duì)合成工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)其結(jié)構(gòu)和性能進(jìn)行了表征，進(jìn)一步測(cè)定了其體外抗凝血活性，以期為木聚糖硫酸酯作為新型抗凝血?jiǎng)┑膽?yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 原料、試劑與儀器

玉米芯取自山東省聊城市，經(jīng)自然風(fēng)干后，選擇無(wú)霉變、無(wú)蟲蛀的玉米芯，破碎，過(guò)0.25 mm孔徑篩。將得到的玉米芯粉末用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液在索氏提取器中抽提12 h，脫除蠟質(zhì)。用去離子水洗滌，真空干燥，置于干燥器中備用。原料的主要化學(xué)組成可參照美國(guó)國(guó)家可再生能源實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)(NREL/TP-510- 42618)測(cè)定，測(cè)得所用原料含纖維素39.03%、半纖維素33.18%、木質(zhì)素14.23%。

N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMSO)、甲酰胺(FA)均為分析純，并在使用前用5?分子篩處理除去水。活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶原時(shí)間(PT)和凝血酶時(shí)間(TT)試劑盒，上海太陽(yáng)生物技術(shù)有限公司。肝素鈉(MW為6 000～20 000 u)，上海博奧生物技術(shù)有限公司。三氧化硫吡啶絡(luò)合物，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。新鮮血液從江蘇省血液中心收集。其他試劑均為市售分析純。

CN61M308113凝膠色譜儀，北京中西化玻儀器有限公司；Thermo Fisher Nicolet IS 10型傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)儀，美國(guó)Thermo公司；Elemental Vario MICRO元素分析儀，德國(guó)Elementar公司；Bruker WNMR-I-500 MHz型核磁共振波譜儀，德國(guó)Bruker公司。

1.2 玉米芯木聚糖的分離制備

取脫蠟后的玉米芯20 g，按照固液比1 ∶25(g ∶mL，下同)加入去離子水，75 ℃抽提3 h。固液分離，向?yàn)V渣中按照固液比1 ∶20加入堿性過(guò)氧化氫溶液(1% H2O2、 5% NaOH)，50 ℃處理16 h。減壓過(guò)濾，用鹽酸中和至中性，減壓濃縮至250 mL，向所得的液體中加入1 L的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%的乙醇，離心分離(8 000 r/min，15 min)，洗滌固體沉淀、去離子水透析、冷凍干燥后得到木聚糖產(chǎn)品，于4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

提純后的玉米芯木聚糖主要化學(xué)組成參照NREL/TP-510- 42618測(cè)定，其中木聚糖73.5%、阿拉伯聚糖14.7%、半乳聚糖5.9%和葡聚糖5.8%(以干質(zhì)量計(jì))。

1.3 木聚糖硫酸酯的合成

玉米芯木聚糖是由D-吡喃型木糖單元通過(guò)β-1,4-糖苷鍵連接而成的，在一定條件下D-木糖單元C-2和C-3鍵上的羥基可以與三氧化硫吡啶絡(luò)合物(SO3·Py)發(fā)生酯化反應(yīng)，合成玉米芯木聚糖硫酸酯，反應(yīng)原理如圖1所示[13]。將2 g LiCl固體加入到20 mL的非質(zhì)子溶劑(DMF、DMSO或FA)中，加熱攪拌至LiCl固體完全溶解。冷卻至室溫后，再加入1.8 g木聚糖，加熱溶解。冷卻至室溫，加入三氧化硫吡啶絡(luò)合物，在給定的溫度和時(shí)間下反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，冰浴冷卻至室溫，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%NaOH溶液中和，加入一定量的無(wú)水乙醇，靜置。離心分離，得到木聚糖硫酸酯粗產(chǎn)品。然后，將木聚糖硫酸酯粗產(chǎn)品在截留相對(duì)分子質(zhì)量為3 500的透析袋中用去離子水透析4天(每隔8 h更換一次水)，除去無(wú)機(jī)鹽和一些小分子的降解產(chǎn)物。最后將溶液冷凍干燥，得到木聚糖硫酸酯產(chǎn)品。

圖1 木聚糖硫酸酯的合成過(guò)程Fig.1 The schematic diagram for the synthesis of xylan sulfate

1.4 分析與表征

1.4.1 硫酸基取代度的測(cè)定 采用氯化鋇-明膠法測(cè)定硫酸基的質(zhì)量分?jǐn)?shù)[14-15]。取代度(DS)可根據(jù)硫元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)(w)來(lái)計(jì)算，公式如下：

DS=(132×w)/(32-102×w)

式中： 132—玉米芯木聚糖分子中木糖單元的相對(duì)分子質(zhì)量； 102—木聚糖分子中1個(gè)羥基被取代后變?yōu)椤狾SO3Na時(shí)，相對(duì)分子質(zhì)量的增加值； 32—S的相對(duì)原子質(zhì)量；w—樣品中硫元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.4.2 凝膠滲透色譜分析 通過(guò)凝膠滲透色譜(GPC)來(lái)測(cè)定木聚糖硫酸酯的相對(duì)分子質(zhì)量。檢測(cè)所用色譜柱型號(hào)為Waters styrage HT6，柱溫箱溫度為25 ℃，檢測(cè)器為SFD RI-2000示差折光檢測(cè)器，流動(dòng)相為0.001 mol/L NaCl溶液，流速為1 mL/min，標(biāo)準(zhǔn)品為聚乙二醇，進(jìn)樣量為20 μL，進(jìn)樣質(zhì)量濃度0.2 g/L，在進(jìn)樣分析前通過(guò)0.25 μm微孔濾膜過(guò)濾樣品。

1.4.3 紅外光譜分析 通過(guò)傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)儀對(duì)合成的木聚糖硫酸酯樣品進(jìn)行紅外光譜分析，儀器的分辨率優(yōu)于4 cm-1，樣品的掃描次數(shù)為16次/s，掃描波數(shù)范圍為525～4000 cm-1。

1.4.4 元素分析 采用元素分析儀對(duì)玉米芯木聚糖和木聚糖硫酸酯進(jìn)行元素分析，主要測(cè)定C、H、O、S這4種元素的含量。

1.4.5 核磁共振分析 木聚糖硫酸酯的13C NMR使用核磁共振波譜儀進(jìn)行分析，以D2O為溶劑。其中13C NMR 譜的掃描數(shù)為10 000，脈沖寬度為11.5 μs，延遲時(shí)間為2 s。

1.5 木聚糖硫酸酯的體外抗凝血活性測(cè)定

將健康的新鮮血液與3.8%檸檬酸鈉溶液按照體積比9 ∶1混合，4 ℃下離心沉淀(8 000 r/min，20 min)，收集上層清液，即為貧血小板血漿(PPP)，并于-20 ℃的冰箱內(nèi)儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｔ谶M(jìn)行抗凝血活性分析時(shí)，37 ℃恒溫融化，3 h內(nèi)使用。

使用APTT、PT和TT來(lái)表示木聚糖硫酸酯的抗凝血活性，并以商業(yè)普通肝素鈉做對(duì)比。首先，將木聚糖硫酸酯配制成不同質(zhì)量濃度的溶液。在37 ℃恒溫條件下，加入PPP，使之充分混合后，再分別加入APTT、PT和TT測(cè)定試劑。在37 ℃恒溫5 min后，加入已經(jīng)預(yù)熱的CaCl2溶液，并且在自動(dòng)凝血計(jì)上記錄凝血時(shí)間。

2 結(jié)果與討論

2.1 木聚糖硫酸酯的合成條件優(yōu)化

硫酸鹽基團(tuán)在多糖的抗凝血活性中起著重要作用，多糖的硫酸基取代度(DS)是生物活性的重要參數(shù)。本試驗(yàn)以硫酸基的取代度(DS)為指標(biāo)，以反應(yīng)溫度(A)、時(shí)間(B)、SO3·Py與木糖單元羥基的物質(zhì)的量之比(C)和反應(yīng)溶劑(D)為因素，設(shè)計(jì)4因素3水平正交試驗(yàn)L9(34)，對(duì)合成工藝進(jìn)行優(yōu)化，從而獲得高取代度的木聚糖硫酸酯。木聚糖硫酸酯合成工藝的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析如表1所示。由表1極差分析可知，各因素對(duì)取代度影響的順序依次為C>D>A>B，即SO3·Py與木糖單元羥基的物質(zhì)的量之比是影響木聚糖硫酸酯取代度的最顯著因素；最佳水平為A2B2C2D1，即以DMF為溶劑，反應(yīng)溫度為55 ℃，時(shí)間為3 h，SO3·Py與木糖單元羥基的物質(zhì)的量之比為1.5 ∶1。經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到該條件下硫酸基取代度為1.53。以最佳條件下合成的木聚糖硫酸酯進(jìn)行后續(xù)的結(jié)構(gòu)表征。

表1 木聚糖硫酸酯合成工藝的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

為驗(yàn)證正交試驗(yàn)的結(jié)果，在DMF溶劑中，SO3·Py與木糖單元羥基的物質(zhì)的量之比為1.5 ∶1條件下，考察了反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度對(duì)取代度和木聚糖硫酸酯得率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 反應(yīng)時(shí)間和溫度對(duì)硫酸基取代度DS(a)和得率(b)的影響Fig.2 Effect of reaction time and temperature on the DS(a) and yield(b) of sulfate group

由圖2(a)可知，反應(yīng)溫度為55 ℃時(shí)，硫酸基的取代度(DS)在0～3 h內(nèi)隨著硫酸化時(shí)間的延長(zhǎng)而迅速增加，在3 h時(shí)達(dá)到最大值1.53，隨著反應(yīng)時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，DS不再增加，反而略有下降。45 ℃也有相似的規(guī)律，但是45 ℃條件下測(cè)得的DS相對(duì)較小。因此，反應(yīng)時(shí)間以3 h為宜。

由圖2(b)可知，反應(yīng)溫度為55 ℃時(shí)，木聚糖硫酸酯的得率在最初反應(yīng)的1 h內(nèi)隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而迅速增加，1 h的得率為68.2%，3 h的得率達(dá)到最大值78.2%，但繼續(xù)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，木聚糖硫酸酯的得率有所減小。木聚糖為易降解多糖，在酸性條件下非常容易發(fā)生降解，另外隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，也導(dǎo)致產(chǎn)物顏色加深，故選擇反應(yīng)時(shí)間為3 h。在4 h之前，45 ℃條件下木聚糖硫酸酯的得率均小于55 ℃的得率；但是隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，當(dāng)反應(yīng)5 h時(shí)45 ℃的得率高于55℃，這是因?yàn)闇囟仍礁撸揪厶窃饺菀捉到猓率沟寐式档汀?/p>

2.2 玉米芯木聚糖硫酸酯的結(jié)構(gòu)表征

2.2.1 GPC分析 硫酸多糖的相對(duì)分子質(zhì)量是影響生物活性的另一個(gè)重要參數(shù)。GPC分析發(fā)現(xiàn)，玉米芯木聚糖(圖3(a))和木聚糖硫酸酯(圖3(b))均呈現(xiàn)單一中心峰，表明它們近似于均聚體結(jié)構(gòu)，組成更加均一。玉米芯木聚糖的數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量為45 394、重均相對(duì)分子質(zhì)量為65 433、多分散系數(shù)為1.441，小于1.5，為結(jié)構(gòu)均一型的聚合多糖。木聚糖硫酸酯的數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量為30 852、重均相對(duì)分子質(zhì)量為36 754、多分散系數(shù)為1.191，小于1.5，為結(jié)構(gòu)均一型的多糖硫酸酯。韓亮等[16]以玉米芯木聚糖為原料，采用氯磺酸-吡啶法對(duì)木聚糖進(jìn)行硫酸化改性，得到木聚糖硫酸酯的多分散系數(shù)大于1.5。所制備的木聚糖硫酸酯結(jié)構(gòu)不如本研究制備的多糖硫酸酯均一。此外，本研究得到的木聚糖硫酸酯的分子質(zhì)量小于玉米芯木聚糖的分子質(zhì)量，說(shuō)明木聚糖的硫酸化過(guò)程中木聚糖分子鏈發(fā)生了斷裂。因此，如何控制木聚糖硫酸酯的相對(duì)分子質(zhì)量是今后研究的關(guān)鍵。

圖3 玉米芯木聚糖(a)和木聚糖硫酸酯(b)的GPC分析Fig.3 GPC analyses of corn cob xylan(a) and xylan sulfate(b)

圖4 木聚糖(a)和木聚糖硫酸酯(b)的FT-IR圖 Fig.4 FT-IR spectra of the xylan(a) and xylan sulfate(b)

表2 玉米芯木聚糖和木聚糖硫酸酯的元素分析

2.2.3 元素分析 玉米芯木聚糖和木聚糖硫酸酯的C、H、O、S這4種元素的含量如表2所示。由表2可知，經(jīng)硫酸化改性后，木聚糖硫酸酯中S含量增加的同時(shí)，H含量降低，說(shuō)明硫酸根取代了木聚糖上的氫，由于S元素的增加，導(dǎo)致C元素所占比例有所下降，與2.2.2節(jié)紅外光譜分析結(jié)果相吻合。

2.2.413C NMR分析 對(duì)玉米芯木聚糖和玉米芯木聚糖硫酸酯進(jìn)行了13C NMR分析，結(jié)果見圖5。由圖5(a)可知，玉米芯木聚糖的13C NMR譜中有δ101.90(C-1)、δ74.10(C- 4)、δ77.70(C-3)、δ76.04(C-2)和δ61.10(C-5)5個(gè)主要信號(hào)峰，為(1→ 4)-β-D-吡喃木聚糖。由圖5(b)可知，經(jīng)硫酸化改性后，13C NMR譜中C-1、 C-2、 C-3、 C- 4、 C-5的δ值分別變?yōu)?05.06、 75.10、 75.26、 78.58、 65.99。C-2和C-3向高場(chǎng)的方向偏移，表明C-2、C-3與呈電負(fù)性的硫酸酯基團(tuán)直接相連。由于C-2和C-3的硫酸化作用，C-1、C- 4和C-5轉(zhuǎn)移到較低場(chǎng)[21-22]。

圖 5 玉米芯木聚糖(a)和木聚糖硫酸酯(b)的13C NMR圖Fig.5 13C NMR spectra of the corncob xylan(a) and xylan sulfate(b)

2.3 體外抗凝血活性分析

酸化多糖的體外抗凝血活性采用經(jīng)典的APTT、PT和TT凝血分析評(píng)估測(cè)定，其中APTT主要用于分析評(píng)估內(nèi)源性凝血途徑，即在Ca2+存在下加入促凝血酶原激酶后形成凝塊所需的時(shí)間[23-24]，TT主要測(cè)定加入血漿后生成的凝血酸使纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白的時(shí)間[13]，PT為凝血酶原時(shí)間，是血檢前狀態(tài)，DIC及肝病診斷的重要指標(biāo)，作為外源性凝血系統(tǒng)的過(guò)篩試驗(yàn)，也是臨床口服抗凝治療劑量控制的重要手段，主要用于評(píng)估外在途徑。

以所制備的玉米芯木聚糖為原料，當(dāng)反應(yīng)溫度為55 ℃、三氧化硫-吡啶絡(luò)合物與木糖單元羥基物質(zhì)的量之比為1.5 ∶1時(shí)，硫酸酯化反應(yīng)時(shí)間為1、2和3 h時(shí)，分別合成木聚糖硫酸酯XS-1、XS-2和XS-3，配制成不同質(zhì)量濃度的溶液進(jìn)行體外抗凝血活性測(cè)定，并與商業(yè)肝素鈉進(jìn)行比較，結(jié)果見表3。

由表3可以看出，與未加入任何凝血?jiǎng)┑目瞻讓?duì)照組相比，加入木聚糖硫酸酯后APTT和TT均延長(zhǎng)，但對(duì)PT的影響相對(duì)較小，這表明木聚糖硫酸酯具有抗凝血活性，可能是通過(guò)影響APTT和TT來(lái)發(fā)揮抗凝血作用的。同時(shí)，木聚糖硫酸酯的抗凝血活性隨著取代度和質(zhì)量濃度的增加而增加，高相對(duì)分子質(zhì)量、低取代度的木聚糖硫酸酯通過(guò)增加樣品質(zhì)量濃度，可以達(dá)到與低相對(duì)分子質(zhì)量、高取代度的木聚糖硫酸酯相當(dāng)?shù)目鼓Ч谋?可以看出，陽(yáng)性對(duì)照組肝素鈉能夠顯著延長(zhǎng)APTT，而木聚糖硫酸酯的抗凝血活性比肝素鈉弱，但是在較高質(zhì)量濃度的條件下XS-3可以達(dá)到與肝素鈉相近的抗凝血效果，這為木聚糖硫酸酯代替肝素鈉成為抗凝血?jiǎng)┨峁┝丝赡堋Ｓ捎谀揪厶橇蛩狨サ慕Y(jié)構(gòu)與抗凝血性能之間存在復(fù)雜的關(guān)系，特別是不同取代度與相對(duì)分子質(zhì)量的相關(guān)性。因此，今后將重點(diǎn)研究木聚糖硫酸酯結(jié)構(gòu)與其功能的關(guān)系。

表3 木聚糖硫酸酯對(duì)APTT、PT和TT的影響

3 結(jié) 論

3.2 通過(guò)體外抗凝血活性測(cè)試發(fā)現(xiàn)，木聚糖硫酸酯可以延長(zhǎng)APTT和TT，且抗凝血活性隨著取代度和質(zhì)量濃度的增加而增加，是一種有效的抗凝性物質(zhì)；同時(shí)，高取代度和高質(zhì)量濃度的木聚糖硫酸酯的抗凝血效果與陽(yáng)性對(duì)照肝素鈉相近，表明木聚糖硫酸酯具有新型抗凝血?jiǎng)┑膽?yīng)用前景。