尾型同源盒轉錄因子2和同源框蛋白A9在膀胱癌組織中的表達及臨床意義*

林 晨,劉湘鄂,吳天玉,許 海

1.湖北省荊州市第三人民醫院泌尿外科(荊州 434000);2.湖北省荊州市第三人民醫院婦產科(荊州 434000); 3.湖北中醫藥大學黃家湖醫院婦科(武漢 430070)

膀胱癌是泌尿系統中發生于膀胱黏膜上的惡性腫瘤，其發展是由多基因及多因素共同參與形成的復雜過程。目前，雖然膀胱癌在臨床診斷及治療上已取得新突破，但患者遠期生存率仍較低，因此，應探討一種新分子標記物，為膀胱癌患者臨床治療及預后提供一定參考依據。尾型同源盒轉錄因子2(Caudal type homeobox transcription factor 2，CDX2)是一種特異性核轉錄因子，參與細胞發育、分化及增殖[1]。同源框蛋白A9(Homeobox protein A9，HOXA9)屬于A簇同源盒基因(Homobox,HOX),對胚胎發育和細胞分化有重要調節作用[2]。已有研究報道[3-4]，CDX2和HOXA9表達與多種腫瘤的發生及預后關系密切，但兩者表達與膀胱癌發病機制關系尚不明確。鑒于此，本研究通過免疫組織化學法(SP法)檢測CDX2和HOXA9蛋白在76例膀胱癌及相應癌旁組織中的表達變化，并與83例正常膀胱黏膜組織中的表達比較，分析兩者異常表達與膀胱癌發生及預后的關系。

資料和方法

1 一般資料 選取2013年9月至2015年9月收治的膀胱癌患者76例，均行手術治療并留取膀胱癌組織標本及相應癌旁組織標本(≥4 cm)，術前均未行放療或化療。其中男45例、女31例，年齡45～76歲、平均年齡(56.23±10.02)歲。T1期20例、T2期17例、T3期26例、T4期13例，低分化19例、中分化16例、高分化41例，病變直徑2～6 cm、平均病變直徑(4.02±1.16) cm，有淋巴結轉移34例、無淋巴結轉移42例。另選取同期因膀胱炎進行治療的83例正常膀胱黏膜組織標本，其中男37例、女46例，年齡45～77歲、平均年齡(56.71±10.15)歲。所有組織標本均用30 g/L的甲醛溶液固定，經石蠟包埋后切片(厚4 μm)。本研究經醫院倫理委員會審批通過。入選標準：所有患者均知情同意；配合研究；肝、腎及心功能正常；具備隨訪條件。排除標準：術前接受過激素類藥物治療；妊娠或哺乳期女性；有溝通障礙者；有其他惡性腫瘤。上述基本資料組間比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

2 研究方法

2.1 CDX2和HOXA9蛋白檢測：采用SP法檢測CDX2和HOXA9蛋白表達。小鼠抗人CDX2單克隆抗體購自上海信裕生物科技有限公司，小鼠抗人HOXA9多克隆抗體購自上海煊翎生物科技有限公司。嚴格按SP法說明書進行操作。由三位高年資病理醫師分別閱片，共同進行結果判定，每張組織切片隨機選擇5個染色均勻的高倍視野(×400)，統計視野內陽性細胞染色情況。陰性：無陽性細胞染色，記為(-)；弱陽性：陽性細胞染色<25%，記為(+)；中陽性：25%≤陽性細胞染色≤50%，記為()；強陽性：陽性細胞染色>50%，記為()。以陰性和弱陽性為CDX2和HOXA9蛋白低表達，中陽性和強陽性為CDX2和HOXA9蛋白高表達。

2.2 隨訪：76例膀胱癌患者出院后每月電話隨訪1次，共隨訪3年，截止日期為2018年10月31日。記錄膀胱癌患者生存人數和死亡人數，隨訪結束后統計總生存率(OS)。

3 統計學方法 采用SPSS 20.0統計學軟件處理數據，計數資料用[例(%)]描述，行χ2檢驗；用Spearman檢驗對膀胱癌患者CDX2、HOXA9蛋白表達進行相關性分析；生存分析采用Kaplan-Meier法，行Log-rank檢驗；COX回歸分析影響膀胱癌患者預后的因素；P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 CDX2和HOXA9蛋白在不同組織中表達 見表1。膀胱癌組織CDX2和HOXA9蛋白陽性率明顯高于正常膀胱黏膜組織和癌旁組織(P<0.05)，癌旁組織CDX2和HOXA9蛋白陽性率與正常膀胱黏膜組織，比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 CDX2和HOXA9蛋白在不同組織中表達

注：與正常膀胱黏膜組織比較，*P<0.05；與癌旁組織比較，△P<0.05

2 CDX2和HOXA9蛋白表達與膀胱癌患者臨床特征關系 見表2。CDX2蛋白表達與膀胱癌患者年齡、性別及病變直徑無關(P>0.05)，與病理分期、分化程度及淋巴結轉移有關(P<0.05)；HOXA9蛋白表達與膀胱癌患者年齡、性別無關(P>0.05)，與病理分期、分化程度、病變直徑及淋巴結轉移有關(P<0.05)。

表2 CDX2和HOXA9蛋白表達與膀胱癌患者臨床特征關系[例(%)]

3 膀胱癌患者CDX2、HOXA9蛋白表達的相關性分析 見表3。

表3 膀胱癌患者CDX2、HOXA9蛋白表達的相關性分析

膀胱癌患者CDX2蛋白表達與HOXA9蛋白表達呈正相關(r=0.401，P<0.05)。

4 CDX2和HOXA9蛋白表達與膀胱癌患者OS關系 76例膀胱癌患者有34例死亡，42例存活，3年OS為55.26%。生存分析結果顯示，CDX2蛋白低表達患者OS(67.35%)明顯高于高表達患者OS(33.33%)(χ2=8.998，P=0.003)；HOXA9蛋白低表達患者OS(70.00%)顯著高于高表達患者OS(38.89%)(χ2=7.099，P=0.008)(圖1)。

5 影響膀胱癌患者預后的危險因素分析 見表4。單因素分析顯示，病理分期、分化程度、病變直徑、淋巴結轉移、CDX2及HOXA9蛋白表達均是影響膀胱癌患者預后的危險因子(P<0.05)。多因素分析顯示，病理分期、分化程度、淋巴結轉移、CDX2及HOXA9蛋白表達是影響膀胱癌患者預后的獨立危險因素(P<0.05)。

圖1 CDX2和HOXA9蛋白表達與膀胱癌患者OS關系

變量單因素分析HR值95%置信區間P值多因素分析HR值95%置信區間P值年齡(<56歲、≥56歲)2.4250.852～5.1270.2612.7540.772～8.1540.325性別(男、女)2.8810.399～2.4540.3343.0530.674～3.4670.099病理分期(T1～T2 、T3～T4)1.9891.328～5.0310.0022.3611.325～4.2060.001分化程度(中、低分化與高分化)2.3151.569～9.5460.0002.1581.227～3.7970.000病變直徑(<4 cm、≥4 cm)2.6261.902～7.3120.0112.5520.827～3.1660.184淋巴結轉移(有、無)2.4511.243～6.1520.0021.7511.035～2.9640.005CDX2蛋白表達(低表達、高表達)3.1541.625～5.0330.0003.2861.662～6.4950.003HOXA9蛋白表達(低表達、高表達)3.0071.227～3.5720.0032.9481.503～5.7810.002

討 論

近年來，膀胱癌患者在免疫治療及放、化療上有一定進展，但患者預后效果差[5]。由于現有腫瘤分子標記物不能充分反映膀胱癌生物學特征，膀胱癌患者術后復發率高，因此，應進一步尋找新腫瘤分子標記物，以期為膀胱癌診斷、治療及術后復發提供依據。研究發現[6-7]， CDX2、HOXA9表達參與結腸癌、肺癌等發展進程，有望作為抗癌治療的靶點和預后預測因子。

CDX2屬于尾型同源基因家族(Caudal-related homeobox，CDX)，位于人染色體13 q12-13，包含2個內含子和3個外顯子。CDX2通過螺旋-環-螺旋方式與DNA結合，并以轉錄因子形式反映DNA表達[8]。CDX2在胚胎細胞發育、分化中起關鍵作用，在多種腫瘤侵襲和轉移中扮演著重要角色[9-10]。有研究發現[11]，在胃癌中，高分化腫瘤組織CDX2蛋白表達高于低分化組織。何娟等[12]研究發現，CDX2蛋白在原發性卵巢癌和轉移性卵巢癌中均高表達，是檢測卵巢癌的重要指標之一。孫丹等[13]研究發現，胃癌組織中CDX2蛋白表達陽性率顯著高于正常胃黏膜組織，與腸型胃癌發生密切相關。本研究通過檢測不同組織中CDX2蛋白表達，發現其表達在膀胱癌組織中最高、癌旁組織次之、正常膀胱黏膜組織最低，與孫丹等[13]研究結果相似，此結果提示CDX2表達上調可促進膀胱癌發展，CDX2表達上調是膀胱癌發生發展的機制之一。為進一步明確CDX2蛋白表達與膀胱癌發生發展關系，本研究對其與膀胱癌臨床特征關系進行分析，發現CDX2蛋白表達與膀胱癌患者病理分期、分化程度及淋巴結轉移有關，與上述研究相似[11]，此結果提示CDX2表達變化可能與膀胱癌病情嚴重程度有關。

同源盒基因(HOX)最初發現于果蠅體內，是一組具有高度保守性的轉錄因子。HOXA9是HOX中重要轉錄調節因子，位于人染色體7p15-p14，轉錄物為外顯子CD和外顯子Ⅱ。HOXA9蛋白具有典型的螺旋-轉角-螺旋結構，在各種胚胎和成熟組織中均有表達[14]。HOXA9蛋白可作為多種腫瘤的診斷標志物，其異常表達與腫瘤的侵襲、轉移及預后關系密切[15-16]。李琳等[17]對急性髓系白血病研究，發現HOXA9mRNA高表達，與患者療效、預后有一定關系。謝忻琰等[18]研究發現，HOXA9mRNA在骨髓增生異常綜合征中高表達，與臨床分期及分化程度關系密切。還有研究發現[19]，在卵巢癌細胞中HOXA9表達上調，與卵巢癌患者不良預后有關。本研究結果顯示，HOXA9蛋白在不同組織中表達高低依次為：膀胱癌組織、癌旁組織、正常膀胱黏膜組織，且HOXA9蛋白表達與膀胱癌組織病理分期、分化程度、病變直徑及淋巴結轉移有關，與上述研究結果相似[17-19]，推測HOXA9蛋白表達上調可能促進腫瘤生長和侵襲，為臨床防治膀胱癌發生發展提供新思路。本研究相關性分析顯示膀胱癌組織CDX2蛋白表達與HOXA9蛋白表達呈正相關，推測兩者表達可能共同參與膀胱癌發展進程，為其防治提供新途徑。本研究進一步探討CDX2、HOXA9蛋白表達對膀胱癌患者遠期生存率影響，結果顯示膀胱癌患者3年OS為55.26%，CDX2、HOXA9蛋白低表達患者OS明顯高于高表達患者，且病理分期、分化程度、淋巴結轉移、CDX2及HOXA9蛋白表達是影響膀胱癌患者預后的危險因子，與上述研究相似[17-19]，提示CDX2和HOXA9蛋白表達與膀胱癌患者遠期生存率有關，推測CDX2和HOXA9蛋白表達可作為判斷膀胱癌患者預后的生物指標。

本研究結果表明膀胱癌組織中CDX2和HOXA9蛋白高表達，兩者可能相互作用參與膀胱癌病情進展，在臨床防治和預后判斷上有一定意義。本研究中CDX2、HOXA9蛋白相互作用對膀胱癌發展的具體機制研究較淺，接下來應針對此問題更深入地研究。